檢測的突變范圍包括點突變和小片段插入缺失。 本發明的基于二代測序的矮小癥基因檢測方法，通過對測序檢出的異常變異進行分析解 讀，明確受檢者的致病突變，實現對矮小癥疾病的準確診斷、針對性的治療以及防止疾病在 家族中復發。
[0018] 依據本發明的又一方面，提供一種檢測矮小相關基因的裝置，該裝置能夠用以執 行實現前述本發明的方法的部分活全部步驟，該裝置包括：A.核酸獲取單元，用于獲取受 檢者的核酸，所述核酸為基因組核酸和/或游離核酸片段；B.捕獲單元，與A單元相連，用 于捕獲來自A單元中的核酸，以獲得矮小相關基因區域；C.序列測定單元，與B單元相連， 用于對來自B單元的矮小相關基因區域進行序列測定，以獲得序列信息；D.檢測單元，與C 單元相連，用于基于來自C單元的序列信息檢測所述矮小相關基因；其中，B單元中的捕獲 是利用前述本發明一方面的以及各個實施方式中的任一芯片進行的。圖1是本發明的一個 實施例中的裝置結構示意圖。對本發明的方法的優點及技術特征的描述，同樣適用本發明 的裝置，而且，本領域人員可以理解，本發明的裝置中的全部或部分單元，可選擇的、可拆卸 的包含一個或多個子單元以執行或實現前述本發明方法的各個【具體實施方式】。
【附圖說明】
[0019] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中 ：
[0020] 圖1是本發明的一個【具體實施方式】中的檢測矮小相關基因的裝置的示意圖；
[0021] 圖2是本發明的一個【具體實施方式】中的檢測矮小相關基因的流程圖。
【具體實施方式】
[0022] 本申請描述中的基因名稱均采用NCBI-Gene里的官方命名（Official Symbol)。另 外，描述中出現的錯義突變（missense)是指，編碼某種氨基酸的密碼子經堿基替換以后， 變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發生改變。某些錯義 突變能使多肽鏈喪失原有功能，許多蛋白質的異常就是由錯義突變引起的。
[0023] 依據一般方法，實現本發明的方法主要包括矮小相關基因檢測芯片的設計，目標 區域捕獲測序技術以及分析流程的開發。
[0024] (1)矮小癥基因檢測芯片設計
[0025] 染色體變異與單基因都可以導致矮小癥，染色體變異又包括染色體數目、結構的 改變，單親二倍體與嵌合現象也可以導致矮小癥。以下僅示例利用本發明方法檢測單基因 以及部分染色體的微缺失與微重復導致的身材矮小。通過對0M頂數據庫以及相關文獻的 查找，獲得438個單基因導致的471種與矮小癥相關的單基因疾病，選取了 25個基因作為 染色體微缺失微重復的marker來標記17種由染色體的微缺失微重復導致的矮小癥。其中， 53個基因的SNP變異可導致53種與矮小癥相關的代謝系統疾病，44個基因中發生的SNP 可導致47種與矮小癥相關的內分泌系統疾病，115個基因的SNP可導致124種與矮小癥相 關的骨骼系統疾病，17個基因的SNP可導致17種與矮小癥相關的皮膚疾病，36個基因可導 致36種與矮小癥相關的神經肌肉系統疾病，19個基因可導致19種與矮小癥相關的血液系 統疾病，11個基因可導致11種與矮小癥相關的耳、鼻、喉五官系統疾病，6個基因可導致6 種與矮小癥相關的免疫系統疾病，5個基因可導致5種與矮小癥相關的消化系統疾病，以及 146個基因可導致153種與矮小癥相關的其它綜合征。在這些基因中會出現1個基因導致 多種疾病，這樣，選取的基因共計463個，所對應488種疾病，具體如表1所示，表1中粗體 顯示的基因表示與多類疾病相關的基因，表2顯示基因數目與對應的疾病數目信息。
[0026] 根據人類基因組HG19,選取上述463個基因的外顯子序列以及側翼±30bp區域 進行探針芯片設計，可以這樣設計探針序列：從hgl9上獲取上述463個基因的外顯子序 列以及側翼±30bp區域的各段參考序列，對每一段參考序列，都從一段參考序列的一端 開始，依次拷貝預定長度的參考序列獲得探針序列，使得最后總的探針能夠覆蓋該段參考 序列至少一次，相鄰探針序列之間可以重疊或不重疊，這邊，預定長度為探針的長度，可為 50-250nt，接著按照合成儀說明書或者委托廠家合成探針制備芯片。獲得的芯片大小約為 2. 5M，該芯片上覆蓋了豐富的捕獲探針，探針覆蓋區域達98. 83%，可以從復雜的基因組中 富集目標DNA片段，在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲約為2. 5M的基因組區域。
[0027] 表 1
[0028]
[0029]
[0030]
[0033] (2)目標區域捕獲測序及分析流程
[0034] 如圖2試驗及分析流程所示，從受檢者全血中提取基因組DNA，并將檢測合格 的DNA同時進行SNP質譜檢測和文庫制備。文庫制備是將lyg基因組DNA打斷成主帶 為200-300bp小片段DNA，然后將打斷后DNA片段進行末端補平，在3'端加堿基"A"，使 得DNA片段能與3'端帶有"T"堿基的特殊接頭連接，經Non-Captured PCR(未捕獲前 擴增）構建完成的文庫，通過矮小癥基因檢測芯片將選取的特定基因的Exon及及側翼 ±30bp區域進行富集，再通過PCR擴增富集后產物，最后通過雜交前后PCR產物QPCR檢 測獲得序列捕獲雜交效率。QPCR檢測合格后，將一定數量的文庫進行上機測序，例如利用 Hiseq2000/2500,對下機數據進行質控，然后對數據進行分析和解讀。其中，文庫制備一個 樣品周期為5-7天。信息分析采用自主開發的信息分析流程進行數據處理，分析流程包含 的未特別交待的軟件、腳本等可通過深圳華大基因公開的網頁或數據庫來獲取，或者定制 深圳華大基因的服務來進行該數據處理，數據處理主要包括過濾、比對、去重復、重比對、質 控、SNV(SNP)+INDEL檢測、注釋等步驟。注釋結果的解讀，主要基于HGMD、BGI Gap以及各 大耳聾致病突變數據庫及文獻搜索查閱進行，同時結合多個功能預測軟件結果及受檢者臨 床表征進行綜合解讀，基本規則參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相關指南進行。
[0035] 傳統的矮小癥基因檢測方法依賴臨床醫生的精確診斷，通過對候選基因的Sanger 驗證來探尋患者的致病原因。若候選基因的Sanger驗證為陰性，需要重新對臨床表征進行 評估來尋找新的候選基因，浪費大量的時間和成本。示例的本發明的方法基于二代測序技 術的矮小癥基因檢測可以靈活挑選基因集，而且性價比更高、針對性更強，適合大規模的臨 床基因檢測服務。本方法提供的矮小癥基因檢測基本上涵蓋了目前已報道的單基因導致的 矮小癥，可以對受檢者進行準確診斷、針對性的治療以及防止疾病在家族中復發。而且，隨 著矮小癥新相關基因的發現，此芯片可以不斷地升級，加入新的基因，從而不斷提升矮小癥 芯片的檢出率。
[0036] 以下結合具體個體樣本對依據本發明的具體檢測方法的運行結果進行詳細的描 述。下面示例，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。在本發明的描述中，除 非另有說明，"多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0037] 除另有交待，以下實施例中涉及的未特別交待的試劑、序列（接頭、標簽和引物）、 軟件及儀器，都是常規市售產品或者公開的，比如購自Illumina公司的hi Seq2000測序平 臺建庫相關試劑盒來進行文庫構建等。
[0038] 實施例
[0039] 對1例非勻稱性矮小，骨骼異常（先天性脊椎后凸、四肢短小），面部特征異常，先 天性肝動脈門靜脈瘺，先天性腦積水的患者進行檢測，患者來自天津殘疾人聯合會。該患者 在臨床上無法確診為哪種疾病，經過上述結合矮小癥相關基因芯片新一代目標區域捕獲測 序（NGS Panel)檢測后，發現在與軟骨發育不良的FGFR3基因上發現了一個熱點有害突變 c. 1138G>A (p. Gly380Arg)，最終患者確診為軟骨發育不良。
[0040] 用鹽析法提取標本DNA，大片段DNA進行超聲打斷，目前使用樣品打斷方法為 Covaris打斷法，將樣品DNA打碎至100-700bp范圍的片段。（注：打斷效果一般以所要求 制備文庫Insert片段主帶位置在200-250bp位置較為理想，若打斷效果不理想則需要進行 重新打斷。）
[0041] 1.文庫制備
[0042] 1. 1末端修復和純化
[00431
[0044] 將配置好的mix震蕩混勻后，每個反應加入25μ L酶反應混合液。反應條件：20°C， 30min〇
[0045] 使用180 μ L Ampure Beads進行產物純化，回收的DNA溶于30yL(其中1.9yL 為損耗）的水中。
[0046] 1. 2 末端加 "A"（A-Tailing)
[0047]
[0048] 將配置好的mix震蕩混勻后，每管加入6. 9 μ L酶反應混合液。反應條件：20°C， 30min。需要說明的是，末端加"A"后可以不用純化。
[0049] 1. 3Adapter的連接和純化
[0050]
[0051] 將配置好的mix震蕩混勻,每個反應加入15 μ L酶反應混合液。反應條件：16°C, 12-16h(過夜）。使用75yL Ampure Beads進行產物純化，回收的DNA溶于35yL(其中 2μ L為損耗）的水中。
[0052] 1. 4Non_Captured 樣品 Pre-LM-PCR
[0053]
[0054] PCR 程序：
[0055] 94°C 2min ；
[0056] 94〇C 15s, 62〇C 30s,72〇C 30s,4cycles ；
[0057] 72 °C 5min ；
[0058] 4°C forever
[0059] 2.芯片雜交，目標區域捕獲富集
[0060] 本實驗中參照NimbleGen使用說明書進行雜交洗脫，獲取目的基因并PCR富集。
[0061] 3.上機測序
[0062] 本實驗采用hiseq2000或hiseq2500PE101+8+101程序進行上機測序。
[0063] 4.信息分析
[0064] 4. 1從測序儀獲取原始數據（FASTQ數據）。
[0065] 4. 2過濾：對原始FASTQ數據進行質量控制，去除常規所說的低質量值數據。
[0066] 4. 3比對：利用SOAP軟件及其默認參數設置，使用Hgl9參考序列進行比對，并行 化處理任務。
[0067] 4. 4去重復：基于Picard的read去重復算法，并行化地從比對結果中找出重復 reads并以SAM/BAM文件的tag方式進行標記。
[0068] 4. 5重比對：使用