Y，Fang JH，Yun JP，et al· Effects of microRNA_29on apoptosis， tumorigenicity and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]· Hepatology，
[0023] 2010,51 (3) :836-845
[0024] llPoly F，Threadgill D，Stintzi A. Identification of Campylobacter jejuni ATCC 43431-specific genes by whole microbial genome comparisons[J]. JBacteri ol，2004, 186(14) :4781-95
[0025] 12Zhang ff G? ffu J H? Li J Q? et al.A subset of skin expressed microRNAs with possible roles in goat and sheep hair growth based on expression profiling Of mammalian microRNAs[J]· Omics，2007, 11 (4):385-396
[0026] 13Thomas Andl，Elizabeth P. Murchison, et al. The miRNA processing enzyme dicer is essential for the morphogenesis and maintenance of hair follicles[J]. Current Biology，2006, 16(10):1041-1049
[0027] 14Yi R，Carroll D，Pasolli HA，et al. Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressed microRNAs[J]. Nat Genet，2006， 38(3) :356-362
[0028] 15Yi R，Poy MN，Stoffel M，et al· A skin microRNA promotes differentiation by repressing sternness[J]. Nature,2008, 452(7184):225-229
[0029] 16Andrei N. Mardaryev, Mohammed I. Ahmed, Nikola V. Vlahov, et al. MicroRNA-31Controls hair cycle-associated changes in gene espression programs of the skin and hair follicle[J]. the FASEB journal, 2010,24(10):3869-3881
【發明內容】
[0030] 針對現有技術中存在的問題與不足，本發明的目的是提供一種快速鑒定山羊絨周 期發育的方法，該方法以miR263b為分子靶標，其調控的靶基因是位于絨發育周期通路中 的一部分關鍵基因，其表達的變化能準確反映具體的絨周期階段，進而能夠起到指示周期 的作用。
[0031] 實現上述發明目的的技術方案是一種快速鑒定山羊絨周期發育的方法，，包括下 列步驟：
[0032] 1、樣品采集
[0033] 剪取剛宰殺的1月、5月和10月內蒙古絨山羊體側約2cm2的皮膚組織，裝入凍存 管，保存于_180°C液氮罐中。
[0034] 2、RNA提取與檢測
[0035] 取出凍存的絨山羊1月、5月和10月皮膚組織，放入用液氮預冷的研缽中并加入 TRIzol研磨至較細粉末后轉入超凈工作臺融化成液體轉移到離心管中，按TRIzol試劑盒 步驟提取RNA。把提取的RNA在70°C變性2min后，使用NanoDrop檢測樣品的濃度、片斷大 小、RIN值和28S: 18S的比值，以鑒定樣品完整性。后于-80°C長期冷凍保存。
[0036] 3、solexa深度測序，構建不同時期絨miRNA數據庫
[0037] 提取的不同時期的RNA送往深圳華大基因公司進行Solexa高通量測序，測序結 果去除低質量和接頭序列及長度小于18nt的小片段。并通過與Rfam(9. 1)數據庫以及 Genbank的blastn比對鑒定去除rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA。跟miRBase所有物種 比，得到保守的miRNA。
[0038] 4、不同時期miRNA表達譜差異分析及靶基因預測
[0039] 尋找絨不同時期間共有及特異miRNA進行表達差異分析并運用預測規則進行靶 基因預測。
[0040] 5、利用 RT-PCR 驗證 miR-263b
[0041] 根據miRBase數據庫中miRNA成熟體的序列設計莖環反轉錄引物和實時熒光定量 PCR 引物，序列分別為 miR-263b-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGT GAAT ;miR-263b-AS:CAGACTTGGCACTGGGAGAAT。然后選取不同時期絨差異表達的 miR-263b， 利用熒光定量RT-PCR技術驗證高通量測序結果可靠性。
[0042] 本發明還有一個目的在于提供一種與山羊絨周期相關的分子靶標 miR263bmiR263b，其序列為：CTTGGCACTGGGAGAATTCAC。
[0043] 本發明還有一個目的在于提供分子靶標miR_263b在判定山羊絨周期不同階段中 的應用。
[0044] 本發明還有一個目的在于提供分子靶標miR_263b在制備與絨周期不同階段判定 的試劑盒中的應用。
[0045] 本發明通過目前比較成熟的miRNA高通量測序的技術手段，對山羊miRNA進行 了全面的鑒定；通過對比山羊皮膚毛囊生長期、休止期和退行期不同發育時期的差異表達 譜，從中篩選出差異表達的miRNA，并通過熒光定量的技術手段對其進行了驗證；通過靶 基因預測和轉錄譜差異比較，尋找毛囊調控的基因，對miRNA的功能進行確證；最后確定 miRNA-263可以作為毛囊周期發育特定的miRNA,研究表明miRNA-263在生長期明顯下調， 在毛囊的退行和休止期表達上調，是重要的絨周期發育的分子靶標。
[0046] 通過鑒定，發現miR_263b與絨周期的發育規律一致，其調控的靶基因位于是絨發 育周期通路中的一部分關鍵基因，其表達的變化能準確反映具體的絨周期階段，進而能夠 起到指示周期的作用。所以miR-263b具有重要的科研理論和應用價值，為絨周期的發育的 預后判斷提供新的線索和依據。
【附圖說明】
[0047] 圖1為miR_263b熒光定量擴增曲線；
[0048] 圖2為miR_263b熒光定量結果。
【具體實施方式】
[0049] 以下結合發明人給出的【具體實施方式】進一步說明本發明的有益效果，而非限制本 發明。
[0050] 1、材料和數據庫：
[0051] miRNA 數據庫：miRbase (http://www. miRbase. org/)
[0052] miRNA比對：tag2miRNA(華大基因開發）
[0053] 同源比對軟件：BLAST(http://blast, ncbi. nlni. nih. gov/Blast. cgi)
[0054] 候選 miRNA 預測：Mireap (http: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)
[0055] 引物在線設計軟件：primer3 (http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)
[0056] 下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑和儀器均可從商業 途徑獲得。
[0057]
[0060] 2、方法：
[0061] 一、探尋絨周期中時空特異表達的miRNA
[0062] 1、RNA的收集與提取
[0063] 取出保存于-180°C液氮罐中的1月、5月和10月內蒙古絨山羊體側皮膚組織， 放入用液氮預冷的研缽中進行研磨，邊研磨邊加液氮，整個過程都不要使組織融化；按每 lOOmg組織加入lmL TRIzol，繼續研磨至較細粉末，轉入超凈工作臺，待融化后，將液體轉移 到1. 5mL離心管中，每管約lmL，室溫放置15min以上；按0. 2mL氯仿/lmL TRIzol的比例加 入氯仿，漩渦震蕩30秒混勻，室溫放置2-3min，離心：4°C，12000rpm，15min ;將離心后上清 液移至一新Eppendorf管中，按0. 5mL異丙醇/lmLTRIzol的比例加入異丙醇，混勾，-20°C 放置1011^11以上，4°(：，12000印111離心151^11;棄去異丙醇，加入11^75%乙醇，用手指將 沉淀塊彈起，顛倒幾次，4 <€，7500印111離心51]1；[11;棄去75%乙醇，超凈臺中自然干燥15~ 30min ;加入一定體積的Nuclease-Free Water (視RNA沉淀大小而定），65°C 5~lOmin助 溶；-20°C短期冷凍保存，_80°C長期冷凍保存。
[0064] 2、總RNA質量檢測
[0065] 將樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，取1 μ L樣品在70°C變性2min后，使用 NanoDrop檢測樣品的濃度、片斷大小、RIN值和28S: 18S的比值，以鑒定樣品完整性。
[0066] 3、solexa 深度測序
[0067] 提取的RNA送往深圳華大基因公司，用Solexa高通量測序技術進行測序并進行數 據的初步分析，得到小RNA庫。
[0068] 4、構建絨周期不同時期的miRNA數據庫
[0069] 三個時期（生長期10月；退休期1月；休止期5月）的測序結果大小分別為 10.94M;12. 27M;11.31M。去除低質量和接頭序列及長度小于18nt的小片段。并通過與 Rfam(9. 1)數據庫以及