定量細胞端粒酶活性的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種定量細胞端粒酶活性的方法。
【背景技術】
[0002] 端粒酶是一個逆轉錄酶，廣泛存在于從低等單核生物如纖毛蟲、酵母到高等脊椎 動物如小鼠、人類的細胞中。能夠在染色體末端延伸六個堿基的重復序列(TTAggg)，延長端 粒長度，從而維持細胞的分裂潛力。目前研究發現，90 % -95 %的人永生化細胞株和85 %的 腫瘤組織中檢測到端粒酶活性，在有轉移傾向的癌細胞組織中更是能夠檢測到端粒酶的高 表達，而在正常組織細胞中幾乎檢測不到端粒酶活性，因而端粒酶活性的檢測對于癌癥的 早期診斷有著重要意義。
[0003] 目前端粒酶活性的檢測已經發展出一些方法，比如端粒酶直接延伸，TRAP等。定量 端粒酶活性也有直接TRAP PCR產物電泳，sybr green法熒光定量，以及蝎型探針，發夾引物 等。由于端粒酶延伸后的PCR過程中產生的DNA是大小不一的重復片段，因而sybr green法 檢測的結果和端粒酶之間無法建立準確的線性關系;探針法由于引入了第三條引物，可能 帶來更多的非特異性擴增。
【發明內容】
[0004]本發明涉及一種定量細胞端粒酶活性的方法，其中使用定量PCR為promega公司的 Plexor qPCR Systems，基本原理是如圖1所示。Is〇-dGTP，is〇-dCTP都是非天然且能被聚合 酶識別的堿基。引物5'端iso-dC上帶有FAM基團，在PCR過程中互補鏈摻入Dabcyl-iso-dGTP 后熒光淬滅，檢測FAM熒光信號的變化可以定量PCR產物量。端粒酶延伸產物長度不一，且 PCR的下游引物配對位點不固定，所以端粒酶延伸產物的PCR產物大小不一。但由于本方法 中檢測PCR產物的探針信號在引物上，故不論PCR產物多長，一條模板只能產生一次信號淬 滅。本方法可以通過檢測引物上的熒光信號淬滅來定量初始模板量，建立端粒酶數量或細 胞數與Ct值的線性關系。
[0005] 在本發明的一個方面，涉及一種定量細胞端粒酶活性的方法，其包括對待測樣品 的細胞裂解物進行利用在5'端標記FAM-iso-dC的引物進行端粒酶的延伸反應和利用 Dabcyl-iso-dGTP進行焚光淬滅的PCR反應。
[0006] 在具體的實施方案中，所述延伸反應的條件為25°C25min。
[0007] 在具體的實施方案中，所述PCR反應的擴增條件為94°C30s，55°C30s，PCR循環數40 個。
[0008] 在具體的實施方案中，所述方法還包括檢測熒光信號的步驟，所述熒光信號檢測 在55°C30s后進行。
[0009] 在具體的實施方案中，所述5 '端標記FAM-iso-dC的引物為5 ' 6FAM-( iso-dc)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID N0:1所示，其中5'6FAM修飾在非天然堿基dC 5' 端的羥基上。
[0010]在具體的實施方案中，所述PCR反應中利用Dabcyl-iso-dGTP和引物對，其中所述 引物對為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1和3所示的序列。
[0011] 在具體的實施方案中，使用購自Promega公司的試劑盒Plexor qPCR Systems進行 延伸反應以及進行實時定量PCR反應。
[0012] 在具體的實施方案中，所述待測樣品為組織細胞，血液，尿液，胸水，或腹水。
[0013] 在具體的實施方案中，所述待測樣品來自染色體端粒為TTAGGG重復序列的哺乳動 物，如人，小鼠或大鼠。
[0014] 在本發明的另一個方面，涉及定量細胞端粒酶活性的試劑盒，其包含用于端粒酶 的延伸反應的在5'端標記FAM-iso-dC的引物和利用Dabcyl-iso-dGTP進行熒光淬滅的PCR 反應的引物。
[0015] 在具體的實施方案中，所述5 '端標記FAM-iso-dC的引物為5 ' 6FAM-( iso-dC)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID N0:1所示，其中5'6FAM修飾在非天然堿基dC 5' 端的羥基上。
[0016] 在具體的實施方案中，用于所述PCR反應中的引物為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO:1和3所示的序列。
[0017] 在具體的實施方案中，所述試劑盒還包含Dabcyl-iso-dGTP。
[0018] 在具體的實施方案中，所述Dabcyl-iso-dGTP來自購自Promega公司的試劑盒 Plexor qPCR Systems〇
[0019] 在具體的實施方案中，所述細胞為組織細胞，或來自血液，尿液，胸水，或腹水;優 選地，所述細胞來自染色體端粒為TTAGGG重復序列的哺乳動物，如人，小鼠或大鼠。
【附圖說明】
[0020] 圖1端粒酶活性檢測原理。（A)端粒酶延伸出不同大小的產物。（B)PCR中下游引物 在模板DNA上延伸到末端摻入dabcyl標記iso-dGTP后，互補鏈上FAM熒光淬滅。
[0021] 圖2.不同濃度Hela細胞核粗提物中端粒酶活性的定量檢測結果。圖（A)是歸一化 后的樣品PCR擴增曲線，橫軸標示PCR循環數，縱軸是每一輪循環中樣品熒光信號歸一化后 的值，實線從右到左分別是1個到12000個細胞數的擴增曲線，虛線為0個細胞數的對照樣 品。圖（B)是Ct值與細胞數的對數的線性關系圖。在圖A曲線中，以縱軸0.9為擴增曲線變化 的閾值對應循環數為每個樣品Ct值，然后以Ct值為縱軸，樣品細胞數的對數為橫軸做曲線， 擬合后的曲線方程為Y = 33-3.4*X，R2 = 0.9986。
[0022] 圖3檢測正常細胞中混有的癌細胞端粒酶活性。圖A，hela細胞和W58細胞以不同比 例混合樣品歸一化后的PCR擴增曲線，橫軸標示PCR循環數，縱軸是每一輪循環中樣品熒光 信號歸一化后的值，虛線為〇個細胞數的對照樣品。圖B，Ct值與細胞數的對數的線性關系 圖。在圖A曲線中，以縱軸0.9為擴增曲線變化的閾值，對應循環數為每個樣品Ct值，然后以 Ct值為縱軸，樣品細胞數的對數為橫軸做曲線，擬合后的曲線方程為Y = 31.32-2.59*X R2 = 0·9921〇
[0023]圖4人膀胱癌細胞5637,人前列腺癌細胞22RV1端粒酶活性檢測以及尿液處理細胞 對端粒酶活性影響。圖A，人膀胱癌細胞5637在尿液處理前后端粒酶活性檢測，橫軸標示PCR 循環數，縱軸是每一輪循環中樣品熒光信號歸一化后的值，實線為歸一化后不同細胞數樣 品的PCR擴增曲線，虛線為0個細胞數的對照樣品。圖B，人前列腺癌細胞22RV1端粒酶活性檢 測，數據表示方式同圖A。
[0024]圖5表示PCR引物序列的更改對端粒酶活性檢測的影響，不同數量hela細胞核蛋白 粗提物端粒酶活性檢測時，歸一化后的PCR擴增曲線。橫軸表示PCR循環數，縱軸是每一輪循 環中樣品熒光信號歸一化后的值，〇個細胞數的樣品為無端粒酶陰性對照。
【具體實施方式】 [0025]使用的材料
[0026] 使用到的引物DNA(I so-MTS和ACX/CXT)是在Takara公司合成。
[0027]使用試劑
[0028] Plexor qPCR Systems購自Promega公司，人宮頸癌細胞（名稱:HeLa)，人胚肺成纖 維細胞（名稱:W58)，人膀胱癌細胞系（名稱:5637)，人前列腺癌細胞系（名稱:22RV1)購自中 國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。PBS購自Thermo Fisher Scientific公司。
[0029] 細胞裂解液可以是來自Qiagen公司的Qproteome Nuclear Protein Kit中Lysis Buffer NL，或者是來自Thermo Fisher Scientific公司的NE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (核蛋白-胞衆蛋白抽提試劑盒)產品中的Cytoplasmic Extraction Reagent(胞衆蛋白抽提試劑）。
[0030] 本發明中使用的細胞裂解液包含以下成分:NaCl 150mM，MgCl21.5mM，Tris-HCl (pH 7 · 5) 10mM，NP400 · 5% (V/V)，蛋白酶抑制劑AEBSF0 · 5mM(Sigma-Aldrich)，RNA酶抑制劑 0·2υ/μ1 (Thermo Fisher Scientific公司），BSA 0.2mg/ml(Takara公司）。
[0031] 細胞核裂解液可以是來自Qiagen公司的Qproteome Nuclear Protein Kit中 Extraction Buffer NX1/NX2,或者是來自Thermo Fisher Scientific公司的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(核蛋白-胞衆蛋白抽提試劑盒)產品中 的Nuclear Extraction Reagent(核蛋白抽提試劑）。
[0032] 本發明中使用的細胞核裂解液包含以下成分：Tris-HCl(pH 7.5)10mM， MgCl21.5mM，EGTA lmM，CHAPS 0.5%(m/V)，甘油 10%(V/V)，DTT 5mM，蛋白酶抑制劑AEBSF 0 · 5mM(Sigma-Aldrich)，RNA酶抑制劑lU/μΙ (Thermo Fisher Scientific公司），BSA0 · 2mg/ ml (Takara公司）。
[0033] 引物序列：
[0034]
[0035] 注:對于6FAM_(is〇-dC)，其中is〇-dC為非天然喊基dC，5'6FAM修飾在非天然喊基 dC 5'端的羥基上。
[0036] 實驗步驟
[0037] 1.端粒酶提取
[0038] a)培養細胞的收集
[0039] 將培養的細胞使用胰酶消化分散后加入含血清培養基終止胰酶反應，500g離心3 分鐘，去掉培養基，細胞用20ml PBS重懸，500g離心3分鐘，加入lml PBS重懸細胞并且轉移 至lml