Genbank的blastn比對鑒定去除rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA。 跟miRBase所有物種比，得到保守的miRNA。
[0070] 5、對不同時期miRNA表達譜進行差異分析
[0071] 尋找生長期、休止期和退行期之間的共有及特異miRNA，進行表達差異分析。對兩 個樣品中表達的已知miRNA統計，判斷在兩樣品之間的表達量是否存在顯著性差異，并分 別使用l〇g2_ratio、Scatter plot圖比較兩者共同表達的miRNA表達量的差異。具體步驟 如下：
[0072] (1)首先將兩個樣品（control和treatment)歸一化到同一個量級。
[0073] 公式：歸一化的表達量=miRNA表達量/樣品總表達量*歸一量級
[0074] (2)然后使用標準化后的結果統計fold_change和P-value及做圖。
[0075]
[0076] 歸一化后，如果兩個樣品的某個miRNA基因表達量為零，則修改為0.01 ;如果兩個 樣品的某個miRNA基因表達量都小于1，由于其表達量過低，不參與差異表達分析。
[0077] 6、靶基因預測
[0078] 使用如下規則采用軟件進行miRNA的靶基因預測：
[0079] (1) sRNA與靶基因間的錯配不得超過4個（G-U配對認為0. 5個錯配）
[0080] (2)在miRNA/靶基因復合體中不得有超過2處發生相鄰位點的錯配
[0081] (3)在miRNA/靶基因復合體中，從miRNA的5'端起第2-12個位點不得有相鄰位 點都發生錯配
[0082] (4)miRNA/靶基因復合體的第10-11個位點不得發生錯配
[0083] (5)在miRNA/靶基因復合體中，從miRNA的5'端起第1-12個位點不得有超過2. 5 個錯配
[0084] (6)miRNA/革巴基因復合體的最低自由能（MFE)應不小于該miRNA與其最佳互補體 結合時MFE的75%
[0085] 7、轉錄譜比較研究
[0086] 二、對 miR-263b 進行 RT-PCR 進行驗證
[0087] 1、設計與合成引物序列
[0088] 選取絨周期不同階段均差異表達的miR_263b，利用莖環引物實時熒光定量 RT-PCR技術驗證高通量測序結果的可靠性。根據miRBase數據庫中miRNA成熟體的序列設 計莖環反轉錄引物和實時熒光定量PCR引物，由博奧生物有限公司合成。序列如下：
[0089] miR-263b-RT ：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGAAT
[0090] miR-263b-AS ：CAGACTTGGCACTGGGAGAAT
[0091] 2、模板制備
[0092] 剪取剛宰殺的1月、5月和10月內蒙古絨山羊體側約2cm2的皮膚組織樣本各三份 裝入凍存管，保存于-180°C液氮罐中。
[0093] 2. 1樣本總RNA提取
[0094] (1)迅速取出組織樣本，在電子天平中稱重約0. 3-0. 5g，放入用液氮預冷的研缽 中進行研磨，邊研磨邊加液氮，整個過程都不要使組織融化；
[0095] (2)按每100mg組織加入lmL TRIzol，繼續研磨至較細粉末，轉入超凈工作臺，待 融化后，將液體轉移到1. 5mL離心管中，每管約lmL，室溫放置15min以上；
[0096] (3)按0· 2mL氯仿/lmL TRIzol的比例加入氯仿，漩渦震蕩30sec混勾，室溫放置 2_3min，離心：4°C，12000rpm，15min ;
[0097] (4)將離心后上清液移至一新Eppendorf管中，按0· 5mL異丙醇/lmLTRIzol的比 例加入異丙醇，混勾，-20°C放置10min以上，4°C，12000rpm離心15min ;
[0098] (5)棄去異丙醇，加入lmL 75%乙醇，用手指將沉淀塊彈起，顛倒幾次，4°C， 7500rpm 離心 5min ;
[0099] (6)棄去75 %乙醇，超凈臺中自然干燥15~30min ;
[0100] (7)加入一定體積的Nuclease-Free Water (視RNA沉淀大小而定），65°C 5~ 10min助溶；
[0101] (8)-20°C短期冷凍保存，-80°c長期冷凍保存。
[0102] 2. 2總RNA質量檢測
[0103] (1)總RNA濃度、純度檢測-NanoDrop測定RNA濃度、純度（上樣2 μ L)。
[0104] (2)總RNA質量檢測-1. 5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0105]
[0106]
[0107] 甲醛變性瓊脂糖凝膠：30ml IX TBE Buffer中加入0.45g瓊脂糖，微波爐中加熱 溶化，輕輕搖動使瓊脂糖充分混勻（肉眼觀察無顆粒狀懸浮物），冷卻至60°C左右時加入 600 μ L甲醛，混勻，倒入RNA專用的制膠器中（7. 5X5. 5cm)，室溫靜置30min左右即可使 用。
[0108] 電泳條件：120 ~130V，15 ~20min。
[0109] 3、熒光定量PCR檢測：
[0110] (l)miRNA逆轉錄反應體系及反應程序
[0111]
[0112] (2)實時定量PCR反應體系與程序
[0113] 按照以下熒光定量PCR體系將試劑按以下順序依次加入到200plEp管中：
[0114]
[0115] 混勻后稍離心，進行熒光定量PCR反應，反應參數設置為：
[0116]
[0117] (3)對miRNA實時定量PCR產物進行1. 5 %非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0118]
[0119]
[0120] 非變性瓊脂糖凝膠：80ml 1 XTBE Buffer中加入1. 2g瓊脂糖，微波爐中加熱溶 化，輕輕搖動使瓊脂糖充分混勻（肉眼觀察無顆粒狀懸浮物），冷卻至60°C左右時加入2 μ L EtBr混勻，倒入制膠器中（15Χ 15cm)，室溫靜置30min左右即可使用。
[0121] 電泳條件：120V，15 ~20min。
[0122] 圖1為miR-263b熒光定量擴增曲線，圖2miR-263b熒光定量結果（1為休止期、2 為生長期、3為退行期）。熒光定量以5s作為對照，采用2 ΛΛη方法進行分析，表明實驗不 同處理組之間在生長期、退行期和休止期之間表達發生顯著變化，以生長期樣本為對照組， miR-263b在休止期發生顯著上調，達到22. 85倍，在退行期也發生顯著上調，達到15. 44倍。 miRNA對基因的表達具有負調控作用，在生長期表達量顯著下降，這與絨生長規律相一致。 因此可以通過263的表達變化來判斷和鑒識絨周期的變化。
【主權項】
1. 一種快速鑒定山羊絨周期發育的方法，其特征在于，包括下列步驟： (1) 樣品米集 剪取宰殺的絨山羊體側約2cm2的皮膚組織，裝入凍存管，保存于-180°c液氮罐中； (2) RNA提取與檢測 取出凍存的絨山羊1月、5月和10月皮膚組織，放入用液氮預冷的研缽中并加入 TRIzol研磨至較細粉末后轉入超凈工作臺融化成液體轉移到離心管中，按TRIzol試劑盒 步驟提取RNA ;把提取的RNA在70°C變性2min后，使用NanoDrop檢測樣品的濃度、片斷大 小、RIN值和28S: 18S的比值，后于-80°C長期冷凍保存； (3) solexa深度測序，構建不同時期絨miRNA數據庫 提取的不同時期的RNA送往深圳華大基因公司進行Solexa高通量測序，測序結果去除 低質量和接頭序列及長度小于18nt的小片段；并通過與Rfam(9. 1)數據庫以及Genbank的 blastn比對鑒定去除rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA ;跟miRBase所有物種比，得到保守 的 miRNA ; (4) 不同時期miRNA表達譜差異分析及靶基因預測 尋找絨不同時期間共有及特異miRNA進行表達差異分析并運用預測規則進行靶基因 預測； (5) 利用 RT-PCR 驗證 miR-263b 根據miRBase數據庫中miRNA成熟體的序列設計莖環反轉錄引物和實時熒光定量PCR 引物，序列分別為 miR-263b-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGA AT ;miR-263b-AS:CAGACTTGGCACTGGGAGAAT ;然后選取不同時期絨差異表達的 miR-263b，利 用熒光定量RT-PCR技術驗證高通量測序結果可靠性。2. 一種與山羊絨周期相關的分子祀標miR263b，其特征在于：該分子祀標miR263b的序 列為：CTTGGCACTGGGAGAATTCAC。3. 權利要求2所述的分子靶標miR-263b在判定山羊絨毛周期不同階段中的應用。4. 權利要求2所述的分子靶標miR-263b在制備與絨周期不同階段判定的試劑盒中的 應用。
【專利摘要】本發明公開了一種快速鑒定山羊絨周期發育的方法。通過對山羊miRNA進行全面的鑒定，對比山羊皮膚毛囊生長期、休止期和退行期不同發育時期的差異表達譜，從中篩選出差異表達的miRNA,并通過熒光定量的技術手段對其進行了驗證；通過靶基因預測和轉錄譜差異比較，尋找毛囊調控的基因，對miRNA的功能進行確證；最后確定miRNA-263可以作為毛囊周期發育特定的miRNA。通過鑒定，發現miR-263b與山羊絨周期發育規律一致，其調控的靶基因是山羊絨發育周期通路中的一部分關鍵基因，其表達的變化能準確反映具體的絨周期階段，進而能夠起到指示周期的作用。所以miR-263b具有重要的科研理論和應用價值，為山羊絨周期發育的預后判斷提供新的線索和依據。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113
【公開號】CN105648050
【申請號】
【發明人】劉志紅, 肖紅梅, 王志新, 李金泉
【申請人】內蒙古農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年4月9日