EP管中，500g離心3分鐘，再次使用lml PBS重懸細胞，500g離心3分鐘，去掉上清PBS。
[0040] b)細胞核蛋白提取
[00411 使用400μ1細胞裂解液重懸步驟a)中得到的細胞，冰上放置5-10min，期間使用槍 頭吹打混勻1-2次。800g離心3分鐘，去掉上清，沉淀部分主要是細胞核。加入50-300μ1細胞 核裂解液，使用槍頭吹打細胞核使之充分重懸，冰上放40min，中間使用槍頭吹打幾次，然后 15000g離心10分鐘，上清即為核蛋白粗提液，其中包含有活性的端粒酶，可以直接進行活性 檢測。得到的核蛋白粗提液在_70°C可以保存半年到一年。
[0042] 2.端粒酶活性檢測
[0043]上述核蛋白粗提液中端粒酶活性的檢測包含端粒酶對引物DNA的延伸和定量PCR 兩個步驟，這兩個步驟在同一個PCR管中完成。反應體系20μ1中包含2*PCR mix 10μ1(來自 定量 PCR 試劑盒 Plexor qPCR Systems)，引物 Is〇-MTS(5yM)0.8yl，引物 Α0Χ(5μΜ)0·8μ1，2μ1 核蛋白粗提液，6.4μ 1水。
[0044]整個反應在QuantStudio 12Κ Flex Real-Time PCR System(Life Technologies，USA)中完成，程序如下：25°C25min延伸反應完成后，接著PCR程序，94°C30s， 55 °C 30s，40個循環。55 °C延伸完成時檢測熒光信號。
[0045]定量PCR結果分析在PRISM6軟件中完成，以每個樣品的熒光值最大值為1，最小值 為〇進行歸一化得到PCR擴增曲線。
[0046]實施例1.檢測hela細胞端粒酶活性以及本發明方法中定量PCR結果與細胞數的關 系
[0047] Hela培養至生長密度70-80%，使用0.5 %胰酶消化分散，含10 %胎牛血清的DMEM 培養基終止胰酶，500g離心3分鐘，去除培養基，使用20ml PBS重懸細胞，用細胞計數板計算 細胞數，取出總數2*106個細胞，按照上述實驗步驟裂解細胞，使用200μ1細胞核裂解液裂解 細胞核得到核蛋白粗提液。
[0048]進行活性檢測前，使用細胞核裂解液將核蛋白粗提液稀釋得到相當于6000、2048、 512、128、32、8、2或0.5個He la細胞數/ul的核蛋白粗提液。以細胞核裂解液為端粒酶陰性對 照。端粒酶活性檢測如上述實驗步驟所描述。端粒酶活性檢測結果如圖2所示，將圖2A中曲 線取閾值作為Y軸，以細胞數的對數為X軸進行擬合得到Ct值與細胞數的對數的線性關系圖 B，從這個結果可以看出，4到12000個細胞中端粒酶活性與細胞數呈良好線性關系，說明本 發明檢測端粒酶活性在該范圍內可靠。
[0049] 實施例2.檢測正常細胞中癌細胞端粒酶活性
[0050] 除了實驗室中培養的癌細胞系，大多數癌組織樣本中都會有正常組織，這些正常 組織一般不含有端粒酶活性，它們的數量可以是癌細胞的10-100倍以上，這些正常細胞的 內容物比如細胞碎片，細胞質成分都可能對端粒酶活性有抑制，對端粒酶活性檢測造成困 難。本案例使用人胚肺成纖維細胞W58,和癌細胞Hela混合在一起模擬正常細胞和癌細胞同 時存在的情況。具體實施如下：
[0051 ] Hela細胞和W58細胞培養至生長密度70-80%，同實施例1胰酶消化以及使用PBS重 懸，細胞計數。然后確定總細胞數4*105個，將hela細胞和W58細胞按1: 0，1:10，1:100，1: 1000，0:1比例混合，細胞核蛋白粗提物的制備同實驗步驟以及實施例1，最終使用160μ1細 胞核裂解液裂解，得到2500cel l/μL的細胞核蛋白粗提物。
[0052]端粒酶活性檢測同實施例1，反應體系和PCR程序，熒光信號檢測完全和實施例1相 同。
[0053]端粒酶活性檢測結果如圖3所示。從圖3Α結果可以看出，w58本身沒有端粒酶活性， 其擴增曲線和對照幾乎重疊，從圖3A的擴增曲線得到圖3B的Ct值和細胞數對數的線性關系 曲線，可以看出，W58細胞僅僅對hela細胞起了稀釋的作用，W58細胞在超出hela 10-1000倍 時沒有抑制端粒酶活性。少至5個hela細胞在4995個W58細胞中能檢測端粒酶活性。
[0054] 實施例3.人膀胱癌細胞5637,人前列腺癌細胞22RV1端粒酶活性檢測以及尿液處 理細胞對端粒酶活性影響
[0055]人膀胱癌細胞5637,人前列腺癌細胞22RV1培養至生長密度70-80%，使用0.5%胰 酶消化分散，含10 %胎牛血清的DMEM培養基終止胰酶，500g離心3分鐘，去除培養基，使用 20ml PBS重懸細胞，用細胞計數板計算細胞數。500g離心3分鐘，去掉上清，使用lml PBS重 懸，將500μ1細胞懸浮液加入到20ml PBS中，另外500μ1細胞懸浮液加入到20ml新鮮尿液，室 溫處理15分鐘后，500g離心3分鐘，去掉上清，使用lml PBS重懸。細胞核蛋白粗提物的制備 方法和流程同實施例1，最終使用細胞核裂解液裂解細胞分別得到4000cellAil的人膀胱癌 細胞核蛋白粗提物以及lOOOOcell/μΙ的人前列腺癌細胞核蛋白粗提物。
[0056] 端粒酶活性檢測前，使用細胞核裂解液將人膀胱癌細胞核蛋白粗提物稀釋至 2000、200、20或2cellAU，將人前列腺癌細胞核蛋白粗提物稀釋至5000、500、50或5cell/y 1，端粒酶活性檢測的定量PCR程序完全同實施例1。
[0057] 端粒酶活性檢測結果如圖4所示。圖4分別是人膀胱癌細胞和人前列腺癌細胞端粒 酶活性檢測結果。從稀釋梯度看，本發明可以檢測40個以上膀胱癌細胞，100個以上前列腺 癌細胞的端粒酶活性。并且結果顯示，尿液處理對膀胱癌和前列腺癌細胞端粒酶活性影響 不大。也即是說本發明的方法可以應用于檢測尿液樣品中細胞端粒酶活性。
[0058] 實施例4. PCR引物序列的變動對端粒酶活性檢測的影響
[0059] 將實施例1中提取的核蛋白粗提液使用細胞核裂解液將核蛋白粗提液稀釋得到相 當于6000，600，60個He la細胞的核蛋白粗提液，端粒酶活性檢測基本參照實驗步驟部分，不 同的是：反應體系20μ1中包含2*PCR mix 10μ1(來自定量PCR試劑盒Plexor qPCR Systems)，引物Iso-MTS 0 · 8μ1，引物ACX或者CXT(5μΜ)0 · 8μ1，2μ1 核蛋白粗提液，6 · 4μ1 水。 PCR程序和信號檢測完全同實驗步驟所描述。
[0060] 端粒酶活性檢測結果如圖5所示，PCR引物使用ACX或者CXT對端粒酶活性影響比較 小，相同細胞數下，ACX和CXT引物的定量PCR曲線非常接近。
【主權項】
1. 定量細胞端粒酶活性的方法，其包括對待測樣品的細胞裂解物進行利用在5 '端標記 FAM-iso-dC的引物進行端粒酶的延伸反應和利用Dabcyl-iso-dGTP進行焚光淬滅的定量 PCR反應。2. 根據權利要求1的方法，其中所述延伸反應的條件為25 °C 25min;優選地，所述PCR反 應的擴增條件為94￡€3〇8,55￡€3〇8，卩0?循環數40個。3. 根據權利要求1-2任一項的方法，其中所述方法還包括檢測熒光信號的步驟，所述熒 光信號檢測在55°C30s后進行。4. 根據權利要求1-3任一項的方法，其中所述5 '端標記FAM-iso-dC的引物為5'6?八皿-(iso-dC)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID NO: 1 所示，其中5 ' 6FAM修飾在非天然 堿基dC 5'端的羥基上;優選地，所述PCR反應中利用DabcyΙ-iso-dGTP和引物對，其中所述 引物對為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1和3所示的序列；更優選地，使用購自 Promega公司的試劑盒Plexor qPCR Systems進行延伸反應以及進行實時定量PCR反應。5. 根據權利要求1-4任一項的方法，其中所述待測樣品為組織細胞，血液，尿液，胸水， 或腹水;優選地，所述待測樣品來自染色體端粒為TTAGGG重復序列的哺乳動物，人，小鼠或 大鼠。6. 定量細胞端粒酶活性的試劑盒，其包含用于端粒酶的延伸反應的在5 '端標記FAM-iso-dC的引物和利用Dabcy Ι-iso-dGTP進行熒光淬滅的PCR反應的引物。7. 根據權利要求6的試劑盒，其中所述5 '端標記FAM-iso-dC的引物為5 ' 6FAM-( iso-dC)-AGCATCCGTCGAGCAGAGTT，其序列為SEQ ID NO: 1所示，其中5'6FAM修飾在非天然堿基dC 5'端的羥基上；優選地，用于所述PCR反應中的引物為SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 1和3所不的序列。8. 根據權利要求6-7任一項的試劑盒，所述試劑盒還包含Dabcy 1-iso-dGTP;優選地，所 述Dabcyl_is〇-dGTP來自購自Promega公司的試劑盒Plexor qPCR Systems。9. 根據權利要求6-8任一項的試劑盒，其中所述細胞為組織細胞，或來自血液，尿液，胸 水，或腹水;優選地，所述細胞來自染色體端粒為TTAGGG重復序列的哺乳動物，如人，小鼠或 大鼠。
【專利摘要】本發明涉及一種定量細胞端粒酶活性的方法和試劑盒。所述方法包括對待測樣品的細胞裂解物進行利用在5’端標記FAM-iso-dC的引物(如SEQ？ID？NO：1)進行端粒酶的延伸反應和利用Dabcyl-iso-dGTP進行熒光淬滅的PCR反應(如利用引物對SEQ？ID？NO：1和2，或SEQ？ID？NO：1和3)。檢測結果顯示，該方法可以得到端粒酶活性和細胞數之間的完美線性關系。使用本發明的技術，可以檢測出正常細胞中混有的低至1/1000的癌細胞的端粒酶，也可以檢測復雜樣品比如尿液樣品中的癌細胞的端粒酶。
【IPC分類】C12Q1/48, C12Q1/68
【公開號】CN105648051
【申請號】
【發明人】譚亥力, 鄭陽麗, 唐駿
【申請人】廈門多維生物醫藥科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年11月25日