一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生命科學領域領域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002]維生素是人和動物為維持正常的生理功能而必須從食物中獲得的一類微量有機物質，在人和動物生長、代謝、發育過程中發揮著重要的作用。維生素大致可分為脂溶性和水溶性兩大類，水溶性維生素主要包括維生素B1、維生素B2、抗壞血酸等。
[0003]抗壞血酸(AsA)即維生素C，在生物體內，抗壞血酸是一種抗氧化劑，保護身體免于自由基的威脅，抗壞血酸同時也是一種輔酶。目前市面已有的檢測抗壞血酸的方法為滴定法和光度分析法。
[0004]滴定法又包括2，6 -二氯靛酚滴定法和直接碘量法兩種。2，6-二氯靛酚滴定法，在滴定過程中還原型抗壞血酸還原2，6-二氯酚靛酚后，自身被氧化生成脫氫抗壞血酸，在沒有雜質干擾時，一定量的樣品提取液還原標準2，6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含抗壞血酸的量成正比。該法缺陷在于特異性差，許多其他還原性的化合物均可以還原2，6_二氯酚靛酚，且生成的有色化合物不穩定，加上測定終點難以準確判斷，給測定結果造成較大誤差。
[0005]直接碘量法的原理是利用碘的氧化性，用淀粉作指示劑，采用碘標準溶液進行直接滴定，當抗壞血酸被碘完全氧化后，過量的碘與淀粉作用而使溶液變藍，并指示滴定終點，依據所消耗的碘量即可計算出試樣中抗壞血酸的含量。但是碘溶液具有不穩定性，易揮發，致使碘標準液的配制與標定比較繁瑣。
[0006]光度分析法常選用的是2，4-二硝基苯肼法，但該法干擾因素較多，2，4-二硝基苯肼除了與抗壞血酸發生反應外，還可以與五碳糖、六碳糖等碳水化合物反應，從而影響了測定結果，且反應顯色時間較長，37°C下的反應需耗時3_4h，操作費時。
【發明內容】
[0007]為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法，可快速準確的測算出抗壞血酸的含量。
[0008]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
一種抗壞血酸含量測定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°c保存，由偏磷酸溶于蒸餾水后配制而成，置于120mL試劑瓶中； 試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由磷酸組成，置于5mL試劑瓶中；
試劑三，維生素C標準品Xl支，-20°C保存，由L-抗壞血酸組成，置于1.5mL EP管中。
[0009]進一步的，所述試劑一中，偏磷酸的質量為0.Sg，蒸餾水的體積為80mL。
[0010]進一步的，所述試劑二中，磷酸的體積為5mL。
[0011]進一步的，所述試劑三中，L_抗壞血酸的質量為0.5mg。
[0012]抗壞血酸不穩定，在樣品處理和儲存過程中極易氧化，而抗壞血酸在254 nm波長下有吸收峰，故高效液相色譜為抗壞血酸的測定提供了簡單、快速且準確的方法。
[0013 ] —種基于高效液相色譜法的抗壞血酸含量測定方法，包括以下步驟:
步驟I儀器和用品的準備；
高效液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、渦旋震蕩器、針頭式過濾器(水系，50個，
0.22μπι)、濾膜(水系和有機系各I個，0.45μπι)、C18柱(4.6X250 mm)、可調式移液器、樣品瓶(50個，2mL)、內襯管(50個，放置在樣品瓶內用于微量樣品進樣)、甲醇(色譜級，200 mL)和超純水；
步驟2溶劑的除雜處理；
將500 mL超純水用0.45μπι的水系濾膜抽濾，將200 mL甲醇用0.45μπι的有機系濾膜抽濾，分別除去超純水和甲醇中的雜質，以防止堵塞色譜柱；
步驟3流動相的配制；
取10mL除雜后的甲醇和400mL除雜后的超純水混合(I: 4的比例)，并加入0.5mL所述試劑二，混勻，配成流動相；
步驟4溶劑的脫泡；
將配好的流動相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱；
步驟5抗壞血酸的提取；
稱取0.1g樣本，加入ImL所述試劑一，冰浴勾楽，采用離心率8000g離心1min，取上清液，用所述試劑一定容至lmL，混勻，使用針頭式過濾器過濾后待測；
步驟6標準品的配制；
在所述試劑三中加入ImL所述試劑一，配成500yg /mL的母液，將母液用所述試劑一分別稀釋成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL和1yg /mL的抗壞血酸標準品溶液，分別將四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液采用針頭式過濾器過濾后待測；
步驟7抗壞血酸含量測定操作步驟；
1)開啟電腦、檢測器和栗，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量1yL，流速
0.6 mL/min，柱溫25°C，保留時間1min，檢測波長254nm，設置完畢保存方法組；
2)啟動輸液栗，使流動相通過色譜柱，待基線穩定后開始加樣；
3 )分別加入四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液I OyL，在I Omin內可分離抗壞血酸，抗壞血酸的保留時間為5min左右，(柱子不同，保留時間有差異)，計算四組不同濃度的抗壞血酸標準品的峰面積；
4)加入樣品10yL，在相應保留時間處檢測抗壞血酸的峰面積；
步驟8抗壞血酸含量的計算；
以標準品濃度(yg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標計算抗壞血酸標準曲線，將樣品峰面積代入標準曲線，計算出樣品抗壞血酸的含量。
[0014]本發明的有益效果是:
1、由于抗壞血酸不穩定，因此本發明的樣本前處理過程快速，可以有效地保留樣本中抗壞血酸，而且提取液成分簡單，僅用1%的偏磷酸溶液即可，成本極低。
[0015]2、本發明的方法采用紫外檢測器，通過保留時間定性、峰面積定量，測定結果更加準確。
[0016]3、本發明的測定步驟只需要在測定前簡單配制試劑一和試劑二，操作簡單，非專業人士也能實施。
[0017]4、本發明的方法在自動進樣器的輔助下可以連續進樣，適用于樣本的批量測定，節省測定時間和人力。
[0018]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明。本發明的【具體實施方式】由以下實施例詳細給出。
【具體實施方式】
[0019]下面將結合實施例，來詳細說明本發明。
[0020]一種抗壞血酸含量測定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°c保存，由0.Sg偏磷酸溶于SOmL蒸餾水后配制而成，置于120mL試劑瓶中；
試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由5mL磷酸組成，置于5mL試劑瓶中；
試劑三，維生素C標準品X I支，-20°C保存，由0.5mg L-抗壞血酸組成，置于1.5mL EP管中。
[0021]抗壞血酸不穩定，在樣品處理和儲存過程中極易氧化，而抗壞血酸在254nm波長下有吸收峰，故高效液相色譜為抗壞血酸的測定提供了簡單