異葉爬山虎藥材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥藥材質量控制技術領域，尤其涉及一種異葉爬山虎藥材中槲皮素 3-0-?Η)-葡萄糖苷的含量測定方法。
【背景技術】
[0002] 異葉爬山虎為葡萄科爬山虎屬異葉爬山虎(Parthenocissus heterophylla(BI ·) Merr.)的干燥莖葉，分布于廣西、安徽、浙江等地區。具有祛風除濕，通龍路、火路、止血，解 毒等功效。廣西民間多用于風濕痹痛、偏頭痛、風濕瘡毒、骨折等病癥的治療。目前，關于異 葉爬山虎的研究，僅見異葉爬山虎果皮中紅色素的研究，關于其藥理活性及化學成分、含量 測定方法的研究尚未見報道。
[0003] 申請人前期試驗表明異葉爬山虎藥材中主要含有黃酮類成分，而黃酮類化合物普 遍具有較好的抗氧化活性，采用比色法測定異葉爬山虎不同萃取部位對二苯基苦酰肼基自 由基[DPPH]的清除作用，說明其具有抗氧化活性。對異葉爬山虎抗氧化活性部位-乙酸乙酯 萃取部位的化學成分進行深入研究，采用多種色譜柱分離方法，分離得到6個化合物，分別 為豆留-4-烯-3-酮、胡蘿卜苷、芹菜素、木犀草素、槲皮素、槲皮素3-〇-i3-D-葡萄糖苷。其中， 槲皮素3-0-?Η)-葡萄糖苷具有治療心肌缺血、缺氧的生理活性。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種準確、可靠、穩定的異葉爬山虎藥材中槲皮 素3-〇-i3_D-葡萄糖苷的含量測定方法，以確保異葉爬山虎藥材的質量，保證其臨床用藥的 安全、有效、穩定。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:異葉爬山虎藥材中槲皮素3-0-β-D-葡萄糖苷的含量測定方法，采用高效液相色譜法，以槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷為對 照，以甲醇:0.05 %磷酸=40~60:50~50為流動相。
[0006] 色譜條件與系統適用性實驗為：以C18鍵合硅膠為填充劑；以甲醇:0.05%磷酸= 40~60:50~50為流動相;流速為1~2ml · min-S柱溫為25~40°C;檢測波長為258~370nm; 理論板數應不低于3000。
[0007] 色譜條件與系統適用性實驗為：以C18鍵合硅膠為填充劑；以甲醇:0.05%磷酸= 46:54為流動相；流速為11111.111^ 1;柱溫為25°(：;檢測波長為25811111;理論板數應不低于 3000 〇
[0008] 對照品溶液的制備按以下操作進行:精密稱取懈皮素 m_D_匍萄糖苷對照品， 用甲醇制成0.02~0.20mg · ml-1溶液。
[0009] 對照品溶液濃度為0.20mg · ml-1。
[0010] 供試品溶液的制備按以下操作進行:取異葉爬山虎藥材粉末2.0g，精密稱定，置具 塞錐形瓶中，加甲醇15ml，超聲40min，放冷，用甲醇補足失重，過濾，取續濾液，過0.45μηι微 孔濾膜，即得。
[0011] 測定按以下操作進行：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10~20yL，注入 高效液相色譜儀，測定，即得。
[0012] 測定按以下操作進行:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10yL，注入高效 液相色譜儀，測定，即得。
[0013] 槲皮素3-〇-i3-D-葡萄糖苷系異葉爬山虎藥材中的活性成分，為確保異葉爬山虎藥 材的質量，保證其臨床用藥的安全、有效、穩定，發明人選定槲皮素3-〇-i3_D-葡萄糖苷作為 異葉爬山虎藥材含量測定的指標，通過對異葉爬山虎藥材中槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷的 含量進行定量研究，建立了一種異葉爬山虎藥材中槲皮素3-〇-i3_D-葡萄糖苷的含量測定方 法。該法采用高效液相色譜法，以槲皮素-3-0-?Η)_葡萄糖苷為對照，以甲醇:0.05 %磷酸= 40~60: 50~50為流動相。實驗證實，本發明的含量測定方法精密度高、重現性好、穩定性 好、回收率高，測定結果準確，完善了異葉爬山虎藥材的質量檢測，為異葉爬山虎藥材質量 標準的建立奠定了基礎。
【附圖說明】
[0014] 圖1是槲皮素3-0-?Η)-葡萄糖苷對照品的高效液相色譜圖。
[0015] 圖2是異葉爬山虎藥材的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0016] -、異葉爬山虎藥材中槲皮素-3-0-?Η)_葡萄糖苷的含量測定方法研究
[0017] 1.儀器與試藥
[0018] 1200系列高效液相色譜儀(美國Agilent)，inersil C18色譜柱(4 · 6mmX 250mm，5μ m)，BS110S型1/10萬電子分析天平(梅特勒公司hDFY-500粉碎機(浙江省溫嶺市林大機械 有限公司），9200S超聲波清洗器(上海）。
[0019] 異葉爬山虎藥材(采自七個不同產地）；槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷對照品（自制）， 純度98.0%，UCNMRjHNMKMS譜圖數據與文獻一致；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分 析純。
[0020] 2.色譜條件的選擇
[0021] 在進行槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷色譜條件的選擇時，尤其對檢測波長及流動相 系統進行了選擇。最后確定的色譜條件為：inersil C18(4.6 * 250mm，5μπι)色譜柱；甲醇： 0.05%磷酸(46:54)為流動相;流速為lml · mirT1;柱溫為25°C ;檢測波長為258nm。
[0022] (1)檢測波長的選擇
[0023]對槲皮素-3-〇-0-D-葡萄糖苷進行全波長掃描，結果顯示其在258nm有最大吸收， 故選擇258nm為檢測波長。
[0024] (2)流動相的選擇
[0025] 考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水為流動相對分離效果的影響。結 果表明，甲醇-〇. 05 %磷酸（46 : 54)較合適，可使樣品中目標峰與雜質峰達到分離，峰型較 好，故選為流動相。
[0026] 3.供試品提取條件的選擇
[0027] (1)提取溶劑的選擇
[0028]考察了甲醇、60%乙醇及95%乙醇作為提取溶劑，結果表明甲醇的提取效率較高。 [0029] (2)提取方法的選擇
[0030]對超聲提取40min，熱回流提取lh，索氏提取4h，二種提取方法提取率進行比較，提 取率基本一致，考慮超聲提取方法操作簡便、省時，故選擇超聲提取。
[0031] (3)提取時間的選擇
[0032] 超聲提取30min，40min，60min，對三者的提取率進行比較，發現30min提取率稍低， 40min與60min提取率基本一致。
[0033] 最終選擇供試品提取方法為加入甲醇，超聲提取40min。
[0034] 4.線性關系考察
[0035] 分別精密吸取槲皮素-3-(H3-D-葡萄糖苷對照品溶液0 · 5ml，1 · 0ml，2 · 0ml，4 · 0ml， 5.0ml于5ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度。分別進樣10μ1，按上述色譜條件測定峰面積。分別 重復進樣3次；以對應的對照品濃度為橫坐標，其峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線。得 回歸方程￥=14.774父-13.525& = 0.9999)，線性范圍0.02~0.2011^·!!!!/1。
[0036] 5.精密度試驗
[0037]精密吸取上述槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷照品溶液各10μ1，連續進樣6次，峰面積 的1?0為1.42%。
[0038] 6.重復性實驗試驗
[0039] 精密稱取同異葉爬山虎樣品共6份，按前述供試品的制備方法制備，測定槲皮素3-04-0-葡萄糖苷含量的1?0分別為0.56%。
[0040] 7.穩定性試驗
[0041 ] 精密吸取同一供試品溶液分別于0，2，4，6，8，24h進樣，測定槲皮素-3-(H3-D-葡萄 糖苷含量的RSD分別為0.67 %，表明供試液在24h內穩定。
[0042] 8.加樣回收率試驗
[0043]采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的槲皮素-3-〇-i3_D-葡萄糖苷，按照前述供試品的制備方法來制備供試液，按照上述測定方法進行測 定，計算回收率，結果見表1。
[0044] 表1加樣回收率試驗(n = 6)
[0045]
[0046] 9.樣品測定
[0047] 按前述制備供試品和對照品溶液，分別進樣，記錄色譜圖（圖1和圖2)，計算槲皮 素-3-0-?Η)_葡萄糖苷的含量，結果見表2。
[0048] 表2 7批藥材中槲皮素3-