、快速且準確的方法。
[0022 ] 一種基于高效液相色譜法的抗壞血酸含量測定方法，包括以下步驟:
步驟I儀器和用品的準備；
高效液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、渦旋震蕩器、針頭式過濾器(水系，50個，
0.22μπι)、濾膜(水系和有機系各I個，0.45μπι)、C18柱(4.6X250 mm)、可調式移液器、樣品瓶(50個，2mL)、內襯管(50個，放置在樣品瓶內用于微量樣品進樣)、甲醇(色譜級，200 mL)和超純水；
步驟2溶劑的除雜處理；
將500 mL超純水用0.45μπι的水系濾膜抽濾，將200 mL甲醇用0.45μπι的有機系濾膜抽濾，分別除去超純水和甲醇中的雜質，以防止堵塞色譜柱；
步驟3流動相的配制；
取10mL除雜后的甲醇和400mL除雜后的超純水混合(I: 4的比例)，并加入0.5mL所述試劑二，混勻，配成流動相；
步驟4溶劑的脫泡；
將配好的流動相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱；
步驟5抗壞血酸的提取；
稱取0.1g樣本，加入ImL所述試劑一，冰浴勾楽，采用離心率8000g離心1min，取上清液，用所述試劑一定容至lmL，混勻，使用針頭式過濾器過濾后待測；
步驟6標準品的配制；
在所述試劑三中加入ImL所述試劑一，配成500yg /mL的母液，將母液用所述試劑一分別稀釋成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL和1yg /mL的抗壞血酸標準品溶液，分別將四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液采用針頭式過濾器過濾后待測； 步驟7抗壞血酸含量測定操作步驟；
1)開啟電腦、檢測器和栗，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量1yL，流速
0.6 mL/min，柱溫25°C，保留時間1min，檢測波長254nm，設置完畢保存方法組；
2)啟動輸液栗，使流動相通過色譜柱，待基線穩定后開始加樣；
3 )分別加入四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液I OyL，在I Omin內可分離抗壞血酸，抗壞血酸的保留時間為5min左右，(柱子不同，保留時間有差異)，計算四組不同濃度的抗壞血酸標準品的峰面積；
4)加入樣品10yL，在相應保留時間處檢測抗壞血酸的峰面積；
步驟8抗壞血酸含量的計算，
以標準品濃度(yg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標計算抗壞血酸標準曲線，將樣品峰面積代入標準曲線，計算出樣品抗壞血酸的含量。
[0023]注意事項:
1、本試劑盒適用于抗壞血酸含量大于0.lug/mL的待檢樣本的檢測，正式測試之前請做預實驗；
2、抗壞血酸不穩定，操作過程應注意避光；
3、為了避免使用過程中柱壓過大，流速由小到大調節；
4、使用完畢時，用50%的甲醇洗色譜柱30min;
5、標準品的稀釋倍數要根據樣品中抗壞血酸濃度確定，樣品中抗壞血酸的峰面積必須落在不同濃度的抗壞血酸標準品的峰面積之內，該標準品稀釋倍數只是一個參考。
[0024]上述實施例只是為了說明本發明的技術構思及特點，其目的是在于讓本領域內的普通技術人員能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡是根據本
【發明內容】
的實質所作出的等效的變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.一種抗壞血酸含量測定試劑盒，其特征在于，包括以下試劑: 試劑一，液體Xl瓶，4°c保存，由偏磷酸溶于蒸餾水后配制而成，置于120mL試劑瓶中； 試劑二，液體X I瓶，4 °C保存，由磷酸組成，置于5mL試劑瓶中； 試劑三，維生素C標準品Xl支，-20°C保存，由L-抗壞血酸組成，置于1.5mL EP管中。2.根據權利要求1所述的抗壞血酸含量測定試劑盒，其特征在于: 所述試劑一中，偏磷酸的質量為0.8g，蒸餾水的體積為80mL； 所述試劑二中，磷酸的體積為5mL; 所述試劑三中，L-抗壞血酸的質量為0.5mg。3.—種采用如權利要求2所述的試劑盒的抗壞血酸含量測定方法，其特征在于，基于高效液相色譜法，包括以下步驟: 步驟I儀器和用品的準備； 高效液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、渦旋震蕩器、水系針頭式過濾器、水系濾膜、有機系濾膜、C18柱、可調式移液器、樣品瓶、內襯管、色譜級甲醇和超純水； 步驟2溶劑的除雜處理； 將500 mL超純水用0.45μπι的水系濾膜抽濾，將200 mL甲醇用0.45μπι的有機系濾膜抽濾，分別除去超純水和甲醇中的雜質，以防止堵塞色譜柱； 步驟3流動相的配制； 取I OOmL除雜后的甲醇和400mL除雜后的超純水混合，并加入0.5mL所述試劑二，混勻，配成流動相； 步驟4溶劑的脫泡； 將配好的流動相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱； 步驟5抗壞血酸的提取； 稱取0.1g樣本，加入ImL所述試劑一，冰浴勾楽，采用離心率8000g離心1min，取上清液，用所述試劑一定容至lmL，混勻，使用針頭式過濾器過濾后待測； 步驟6標準品的配制； 在所述試劑三中加入ImL所述試劑一，配成500yg /mL的母液，將母液用所述試劑一分別稀釋成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL和1yg /mL的抗壞血酸標準品溶液，分別將四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液采用針頭式過濾器過濾后待測； 步驟7抗壞血酸含量測定操作步驟； 1)開啟電腦、檢測器和栗，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量10yL，流速0.6 mL/min，柱溫25°C，保留時間1min，檢測波長254nm，設置完畢保存方法組； 2)啟動輸液栗，使流動相通過色譜柱，待基線穩定后開始加樣； 3 )分別加入四組不同濃度的抗壞血酸標準品溶液I OyL，在I Omin內可分離抗壞血酸，抗壞血酸的保留時間為5min，計算四組不同濃度的抗壞血酸標準品的峰面積； 4)加入樣品10yL，在相應保留時間處檢測抗壞血酸的峰面積； 步驟8抗壞血酸含量的計算； 以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標計算抗壞血酸標準曲線，將樣品峰面積代入標準曲線，計算出樣品抗壞血酸的含量。
【專利摘要】本發明公開了一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法，該試劑盒包含的試劑有：由偏磷酸溶于蒸餾水后配制而成的試劑一，由磷酸組成的試劑二，以及由？L-抗壞血酸組成的試劑三。本發明的樣本前處理過程快速，可以有效地保留樣本中抗壞血酸，而且提取液成分簡單，僅用1%的偏磷酸溶液即可，成本極低。本發明的方法采用紫外檢測器，通過保留時間定性、峰面積定量，測定結果更加準確。本發明的測定步驟只需要在測定前簡單配制試劑一和試劑二，操作簡單，非專業人士也能實施。本發明的方法在自動進樣器的輔助下可以連續進樣，適用于樣本的批量測定，節省測定時間和人力。
【IPC分類】G01N30/24, G01N30/02, G01N30/06
【公開號】CN105651878
【申請號】
【發明人】趙林川
【申請人】蘇州科銘生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月31日