工序;對所述倍篩選的昆布 使用適當溫度的天然洗涂水或添加物來去除鹽分和不純物質的洗涂工序;在所述洗涂工序 后，對昆布W約1~3cm適合大小進行切割而提高昆布表面積的切割工序;對所述被切割的 昆布在50~60°C下完全烘干約3~5小時的烘干工序;對所述被完全烘干的昆布在研磨機 (grinder)中研磨為8~9mesh來制成粉末狀的研磨工序。
[0033] 在錐形燒瓶中放入10~30g的昆布粉末和lOg的化C1，并將其在1L蒸饋水中進行溶 解，然后，添加15g的瓊脂粉而進行溶解。對上述組合物被溶解的溶液在高壓蒸氣滅菌器中 在12rC條件下加壓滅菌15分鐘后，再對經過上述滅菌過程的培養基將溫度降低到60°C后， 在陪替氏培養皿中倒入約25ml分量W進行凝固。
[0034] 實施例2昆布病原細菌的分離過程
[0035] 利用本發明的昆布固體培養基實施了昆布的疾病檢查。為進行昆布的病原細菌的 分離而使用的昆布試料是W自2014年4月至9月位于韓國全羅南道競島、蓋山、慶尚北道浦 項的昆布養殖場為對象周期性地采集推測可能生病的昆布，并將其在冷藏狀態下迅速搬運 到實驗室后，用于疾病的檢查中。
[0036] 在上述疾病檢查中使用的試料是被判斷為受到細菌感染的患部的昆布葉體和被 脫落的昆布葉體等。在試料的區分中，單純從外觀上葉體被脫落的試料被區分為1~3,被發 現作為細菌感染癥狀的葉體孔桐癥狀的試料被區分為4~5。（參考表1)
[0037] 在細菌的檢查中，使用自來水和70%的酒精對異常部位的昆布葉體去除附著在外 部的污染源后，使用滅菌海水按l:9(lg/9ml)來進行處理并磨碎。使用上述磨碎液在包含 0.5%褐藻酸的腦屯、浸液瓊脂(brain hea;rt in化sion aga;r，BHIA)、海生菌瓊脂(marine agar,Μ)、3%昆布培養基(DA)上按10化1量來進行了涂抹后，在20~25°C中培養了7天而對 細菌進行了分離。在培養細菌的培養基中，被分離為50個W上的相同菌落時將其判斷為陽 性。圖2表示利用本發明的昆布培養基的昆布病原細菌的分離照片。
[0038] 此外，根據將昆布粉末的含量變化為10~30g來制造培養基的實驗結果，與在lOg 昆布粉末中放入1L蒸饋水的情況（1 % )和在20g昆布粉末中放入1L蒸饋水的情況（2%)相 比，在30g昆布粉末中放入1L蒸饋水的情況(3%)確認了細菌生長得更好。因此，昆布粉末優 選包括至少3%的比例。
[0039] 實施例3昆布病原細菌的命名確認過程
[0040] 對于從培養基分離的細菌，利用沸騰(boiling)法來提取DNA后，基于原核生物的 16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA)基因來制備的聚合酶連鎖反應中所使用的引物 (primer)為如下：
[0041 ] 519F:5'-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3'1094R:CTTAACCCAACATCTCACGA
[0042] 使用上述引物進行了聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction、PCR)。反應 條件是在94°C中進行5分鐘的預變性（pre-denature)后，在94°C下進行30秒鐘的變性 (denature)，在57°C中進行30秒鐘的退火處理（annealing)，在72°C下進行1分鐘的延伸 (extension)反應進行了30個周期（cycles)后，在72°C中進行了5分鐘的post延伸（post? extension) 。
[0043] 使用1.5%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)對PCR擴增產物進行了確認，并利用DNA凝 膠回收提取試劑盒(gel DNA extration kit)進行了提煉后，使用ABI PRISM染料終止子化 學測序(ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry)分析了堿基序列。對經分析 的堿基序列是實施美國國家生物技術信息中屯、（national center for biotechnology infe;rmation，NCBI)的基本局部比對捜索工具的捜索(blast search)來進行了命名確認。
[0044] 實施例4昆布病原細菌分離實驗結果
[0045] 圖3表示包括本發明的昆布培養基的按照培養基種類培養后分離的病原細菌。下 列表1表示根據現有的市場中銷售的冊IA培養基(Brain head irrfusion agar)、MA培養基 (marine agar)和本發明的昆布培養基(Dasima agar)分別分離的細菌。對于分離的細菌數 量，用菌落形成單位(colony forming unit)來進行了測量。
[0046] 表 1
[0047]按各培養基分離的細菌數量 [004引
[0049] 查看表1的結果，在1號試料（病變：葉體脫落）中，只有在MA出現了海洋細菌 (Marine bacte;rium)(130個）和交替單胞菌（Alteromonas sp. )(123個）的分離。2號試料 (葉體脫落）中，在BHIA中有未命名確認的細菌(52個)被分離，在MA和DA中假交替單胞菌分 別被分離為70個和83個。在3號試料(葉體脫落）中，在BHIA中弧菌(Vibrio SP. )(820個)被 分離，在Μ中有細菌菌落不同的巧中弧菌被分離。但在DA中細菌菌落不同的假交替單胞菌分 別被分離為350個和248個。
[0050] 在4號試料(葉體孔桐）中，在BHIA中被分離了弧菌(320個），在ΜΑ中被分離了海洋 細菌（1200個)和假交替單胞菌(640個）。但在DA中只有假交替單胞菌(53)被分離，在5號試 料(葉體孔桐）中，只在Μ中有Re inekea sp.(2080個)和假交替單胞菌(700個)被分離。
[0051 ]根據上述各培養基中檢測出的菌種結果，在BHIA中有弧菌被分離，而在MA中有海 洋細菌、交替單胞菌、假交替單胞菌、弧菌、Reinekea sp.被分離，在DA中只有假交替單胞菌 特異地被分離，從而可知DA培養基可用于假交替單胞菌疾病的診斷。
[0化2] 產業上的利用可能性
[0053]在本發明的昆布培養基中能夠對作為在昆布中發生的細菌性斑點病的原因菌的 假交替單胞菌進行特異且單純地培養并分離，它可作為昆布的細菌性斑點病是否早期感染 W及作為病癥體現的葉體斑點病的預報系統來使用，由此能夠將其適用于細菌性斑點病的 疾病診斷及預報系統，從而提前阻止損害的擴散，因此具有產業上的利用可能性。
【主權項】
1. 一種昆布培養基，其特征在于，包括昆布粉末、NaCl、瓊脂粉及蒸餾水，所述昆布培養 基能夠僅對作為昆布斑點病原因菌的假交替單胞菌特異地進行分離培養。2. 根據權利要求1所述的昆布培養基，其特征在于，所述昆布粉末以1L蒸餾水為基準包 括有l〇g以上。3. -種昆布培養基的制造方法，所述昆布培養基能夠僅對作為昆布斑點病原因菌的假 交替單胞菌特異地進行分離培養，其特征在于，所述昆布培養基的制造方法包括下述步驟： 以1L蒸餾水為基準，按照10~30g的昆布粉末、10g的NaCl和15g的瓊脂粉的比例添加并 進行溶解； 在高壓蒸氣滅菌器中對所述溶解溶液在121°C下加壓滅菌15分鐘； 將所述滅菌后的培養基的溫度降到60 °C，然后在陪替氏培養皿中放入25ml分量并對其 進行凝固。4. 一種昆布的假交替單胞菌感染診斷方法，其特征在于，利用自來水和70%濃度酒精 在昆布的異常部位葉體上去除附著在外部的污染源，再將所述去除污染源的昆布葉體與滅 菌海水以lg:9ml的比例進行處理并進行磨碎，將所述磨碎液在權利要求1所述的昆布培養 基上涂抹1〇〇μ1后，在20~25°C下培養7天，由此僅對作為昆布斑點病原因菌的假交替單胞 菌特異地進行分離培養。
【專利摘要】本發明提供昆布培養基及其制造方法和昆布病原細菌感染診斷方法，其中涉及利用昆布對棲息于昆布內部的病原細菌進行分離的方法，其中，利用昆布培養基(DA)僅對作為引起昆布細菌性斑點病(bacterial？spot？disease)的原因菌的假交替單胞菌特異地進行分離，將其適用于細菌性斑點病的疾病診斷及預報系統，由此能夠提前阻止損害的擴散。
【IPC分類】C12Q1/04, C12R1/01, C12N1/20
【公開號】CN105670957
【申請號】
【發明人】樸明愛, 金錫烈, 池寶榮, 全昌永, 吳允敬, 李筍楨, 吳明柱, 金尉植, 金鍾五, 崔成劑
【申請人】大韓民國(管理部署:國立水產科學院)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年11月3日