一種基于23S-5S rRNA基因測序譜圖分析法的銅綠假單胞菌分型鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基于23S-5S rRNA基因測序譜圖分析法的銅綠假單胞菌分型鑒定 方法，可用于運種病原菌的鑒定和分子分型。
【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學技術的興起，使得在分子水平上鑒別細菌的方法更為深入與準 確，測序法則是其中之一。原核生物rRNA基因5 '端至3 '端依次為：5'-165(1540 6口)-1了5- 23S(2900 bp)-ITS-5S(120 bp)-3'。其中，16S rRNA因其含有較多的變異區和保守區，且分 子大小適宜，其序列分析作為微生物系統分類的主要依據已得到了廣泛的應用，技術已較 為成熟，數據庫已較為完善，但對于相近種及種內株間的區分力度尚缺。16S-23S rRNA、23S rRNA、5S rRNA等片段雖然均被用于微生物鑒定，但各有優缺點，也并非理想細菌鑒定遺傳 標記。而目前為止，國內外對23S-5S區間序列在鑒定微生物方面的研究報導寥寥可數，幾近 空白。銅綠假單胞菌是一種重要的致病菌，為醫院感染中的主要致病菌之一。為控制醫院感 染，有必要對醫院感染事件中的致病菌進行溯源，但銅綠假單胞菌的溯源方法不多，操作比 較復雜，對基層醫療機構可行性不強。本研究針對銅綠假單胞菌的23S-5S rRNA基因序列設 計特異性引物，應用FTA卡-SYBR Green I巧光PCR直接擴增該片段并進行測序，成功進行銅 綠假單胞菌進行鑒定和基因分型，可應用于銅綠假單胞菌的同源性分析和分子溯源。
【發明內容】
[0003] 一種基于23S-5S rRNA基因測序譜圖分析法的銅綠假單胞菌分型鑒定方法。使用 該方法不僅可W準確鑒定銅綠假單胞菌，還可W進行分子分型。針對銅綠假單胞菌的23S- 5S rRNA基因序列設計特異性引物，應用FTA卡-SYBR Green I巧光PCR直接擴增該片段，再 將PCR產物簡單稀釋后進行測序反應，分析經毛細管電泳后比對測序譜圖及數據，沒有重疊 峰的直接讀取序列，提交由美國國家生物技術中屯、(NCBI)網站化AST在線軟件比對W確定 細菌種類，有重疊峰的人工辨認重疊起始處往后兩種序列各15個bp的測序結果，W序列比 對和詳圖分析結果獲得鑒定及分型結果，采用此方法，銅綠假單胞菌可分成a-g共7種分子 亞型。
[0004] 用于銅綠假單胞菌23S-5S rRNA基因測序鑒定法的引物序列
基于上述目的，本發明采用W下具體實施方案： 采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、實時巧光PCR技術擴增目標片段，上機進行雙脫氧測 序。
[0005] 基于本發明研制的巧光PC財夾速測序試劑套裝包括下列試劑： 1)FTA卡 1片。
[0006] 2)PCR反應液1管，內裝SYBR GREEN巧光PCR反應液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的 Buffer、SYBR GREEN溶液。
[0007] 3化下游引物各惟，內裝目標序列擴增及測序引物。
[000引 4)雙脫氧測序試劑一套，包括Bi曲ye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5 X ), BigDye Mix。
[0009] 5)測序產物純化試劑一套，包括XTerminator solution、SAM solution各 1 管。
[0010] 6巧離子水惟，內裝無 DNA酶的滅菌去離子水。
[0011] 基于本發明建立的基于巧光PCR的快速測序方法，按下列步驟進行： 1)FTA樣品卡的制備 細菌懸液經適當稀釋后（大約6Xl〇4至6X107 C即/mL)，吸取lOOul滴于FTA卡上，室 溫驚干備用。
[0012] 2)SYBR Green實時巧光PCR直接擴增目標片段 配制反應體系：按常規配制SYBR Green實時巧光PCR反應體系，加入上下游引物的終濃 度均為lOOngAiL，用打孔器在FTA卡打出直徑0.5mm的紙片加入體系，終體積為20化。巧光 PCR直接擴增:使用巧光定量PCR儀進行擴增，擴增反應條件為，95°C 2min，[95°C 10s，51°C 20S，72°C 40S談光采集）]35次循環，72°C lOminJCR擴增效果評價：巧光PCR產物合格的 標準為Cp(或Ct)值小于30且烙解曲線顯示有一個或多個明顯主峰為合格，沒有峰或全部峰 化值<76 °C為擴增產物不合格。
[OOU] 3)測序PCR反應 如果巧光PCR擴增產物合格，將PCR產物依據Cp值大小稀釋5-10倍，取已稀釋的產物lul 置于 PCR 管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5 X),測序引物 (上游或下游引物）的終濃度為1 OOng/uL，終體積為1 OuL，使用梯度PCR儀進行擴增。擴增條 件為:98°C 2min，（96°C 10S，50°C 5s，60°C 4min)25次循環。
[0014] 4)產物純化、毛細管電泳和序列讀取、分析和比對 在96孔板中加入產物luL，SAM solution 9uL，Bi曲ye XTerminator solution 化L。震 蕩5min，2000g離屯、2min，蓋上測序用硅膠封蓋，用基因分析儀進行毛細管電泳，電泳完畢 機器自動根據測序譜圖并進行序列讀取，可獲得目標片段基因序列。分析經毛細管電泳后 比對測序譜圖及數據，沒有重疊峰的直接讀取序列，使用NCBI網站上的"nucleotide blast"功能進行序列比對，數據庫選用"Nucleotide collection (nr/nt)"，選取比對結果 匹配率最高的一項(一般為首項)作為最終的細菌鑒定結果;有重疊峰的人工辨認重疊起始 處往后兩種序列各15個bp的測序結果，W序列比對和詳圖分析結果獲得最終鑒定及分型結 果。根據測序結果及譜圖的綜合分析情況，可將銅綠假單胞菌分為a-g共巧巾亞型，詳見圖1。
[0015] 與最接近現有技術相比，本發明具備W下有益效果。
[0016] 1.本發明提供的試劑和方法可對銅綠假單胞菌的23S-5S rRNA基因進行正確測 序，W序列比對和詳圖分析結果獲得最終鑒定及分型結果，結合免費的公共基因數據庫檢 索和巧巾亞型典型測序譜圖，可準確地鑒定運種病原菌并進行分子分型。
[0017] 2.本發明提供的試劑和方法對銅綠假單胞菌進行鑒定和分子分型，是一種新型 的分型方法，增加細菌鑒定的準確度和判別力，并有助于同源性分析和分子溯源。
[0018] 3.銅綠假單胞菌的23S-5S rRNA基因測序鑒定和分子分型方法的發明，使得在基 層實驗室推廣基因測序法鑒定致病菌并進行同源性分析和分子溯源成為可能。
【附圖說明】
[0019] 圖1是利用本發明設及的試劑和方法進行銅綠假單胞菌進行鑒定和分子分型基因 測序的巧巾亞型及對應的典型譜圖。
[0020] 其中a.其中重疊序列頭15個bp為（信號強的序列在前)AAACCTTGAAATCCC/CCCC TTGAAATCAAA;b.重疊序列頭15個bp為（信號強的序列在前）ACACCTTGAAATCCC/CCC CTTGAAATCAAA;c.重疊序列頭15個bp為（信號強的序列在前）ACACCTTGAAATCACAT/C ACCTTGAAATCACA;d.重疊序列頭15個bp為（信號強的序列在前）CACCTTGAAATCACA/ACA CCTTGAAATCACAT;e.重疊序列頭15個bp為（信號強的序列在前）AAACCTTGAAATCCC/CAC CTTGAAATCAAA; f.無重疊序列，且包含"GCAAACACCTTGAAATCAC"序列；g.無重疊序列，且包 含"GCAAAACACCTTGAAATCAC' 序列。
[0021] 實施例:待測序鑒定病原菌4株:來自臨床標本分離菌株，為斜面生長菌苔。已經經 過傳統的生化反應鑒定為銅綠假單胞菌。
[0022] 檢測步驟:應用上述試劑和方法進行檢測。
[0023] 1)樣品的處理與DNA模板的提取 上述分離菌株細菌懸液經適當稀釋后（大約6Xl〇4