至6X107 CFU/mL)，吸取lOOul滴 于FTA卡上，室溫驚干備用。
[0024] 2)SYBR Green實時巧光PCR反應體系配制 將SYBR Green實時巧光PCR從冰箱取出后，置室溫融化，2000巧m離屯、lOsec。按下表計 算試劑用量。
[0025] SYBR Green實時巧光PCR反應體系配制表
將45化PCR反應液、4.5化上游引物、4.5化下游引物、3化L滅菌去離子水、分別加入 1.5mL離屯、管中，混勻后，2000 rpm離屯、lOsec，分別向設定的陽性反應孔、陰性反應孔和樣 品反應孔中加入20化/孔。
[0026] 3)加樣 用打孔器在FTA卡打出直徑0.5mm的紙片1片加入體系，用反應膜封住反應孔，置于巧光 PCR儀上檢測。
[0027] 4)反應參數及PCR擴增效果評價 巧光PCR儀選擇FAM通道，擴增反應條件為，95°C 2min，[95°C 10s，5rC 20S，72°C 40S (巧光采集）]35次循環，72°C lOmiruPCR擴增效果評價：巧光PCR產物合格的標準為Cp(或 Ct)值小于30且烙解曲線顯示有一個或多個明顯主峰為合格，沒有峰或全部峰Tm值<76°C為 擴增產物不合格。
[002引 5)測序PCR反應 如果巧光PCR擴增產物合格，將PCR產物依據Cp值大小稀釋5-10倍，取已稀釋的產物lul 置于 PCR 管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5 X),測序引物 (上游或下游引物）的終濃度為1 OOng/uL，終體積為1 OuL，使用梯度PCR儀進行擴增。擴增條 件為:98°C 2min，（96°C 10S，50°C 5s，60°C 4min)25次循環。
[0029 ] 6 )產物純化、毛細管電泳、序列讀取、分析和比對 在96孔板中加入產物luL，SAM solution 9uL，Bi曲ye XTerminator solution 化L。震 蕩5min，2000g離屯、2min，蓋上測序用硅膠封蓋，用基因分析儀進行毛細管電泳，電泳完畢 機器自動根據測序譜圖并進行序列讀取，可獲得目標片段基因序列。分析經毛細管電泳后 比對測序譜圖及數據，沒有重疊峰的直接讀取序列，使用NCBI網站上的"nucleotide blast"功能進行序列比對，數據庫選用"Nucleotide collection (nr/nt)"，選取比對結果 匹配率最高的一項(一般為首項)作為最終的細菌鑒定結果;有重疊峰的人工辨認重疊起始 處往后兩種序列各15個bp的測序結果，W序列比對和詳圖分析結果獲得最終鑒定及分型結 果。根據測序結果及譜圖的綜合分析情況，對照圖1典型譜圖，可確定銅綠假單胞菌的分子 亞型。
【主權項】
1.一種基于23S-5S rRNA基因測序譜圖分析法的銅綠假單胞菌分型鑒定方法，使用該 方法不僅可以準確鑒定銅綠假單胞菌，還可以進行分子分型，針對銅綠假單胞菌的23S-5S rRNA基因序列設計特異性引物，應用FTA卡-SYBR Green I熒光PCR直接擴增該片段，再將 PCR產物簡單稀釋后進行測序反應，分析經毛細管電泳后比對測序譜圖及數據，沒有重疊峰 的直接讀取序列，提交由美國國家生物技術中心(NCBI)網站BLAST在線軟件比對以確定細 菌種類，有重疊峰的人工辨認重疊起始處往后兩種序列各15個bp的測序結果，以序列比對 和詳圖分析結果獲得鑒定及分型結果，采用此方法，銅綠假單胞菌可分成a-g共7種分子亞 型； 用于銅綠假單胞菌23S-5S rRNA基因測序鑒定法的引物序列基于上述目的，本發明采用以下具體實施方案： 采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、實時熒光PCR技術擴增目標片段，上機進行雙脫氧測 序； 基于本發明研制的熒光PCR快速測序試劑套裝包括下列試劑： 1. FTA卡1片； 2. PCR反應液1管，內裝SYBR GREEN熒光PCR反應液，包括Taq酶、dNTP、含Mg2+的Buffer、 SYBR GREEN溶液； 上下游引物各1管，內裝目標序列擴增及測序引物； 雙脫氧測序試劑一套，包括BigDye Terminator ν3 · 1 Sequencing Buffer (5 X )， BigDye Mix； 測序產物純化試劑一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管； 去離子水1管，內裝無 DNA酶的滅菌去離子水； 基于本發明建立的基于熒光PCR的快速測序方法，按下列步驟進行： 1. FTA樣品卡的制備 細菌懸液經適當稀釋后(大約6X104至6X107 CFU/mL)，吸取lOOul滴于FTA卡上，室溫 晾干備用； 2. SYBR Green實時熒光PCR直接擴增目標片段 配制反應體系：按常規配制SYBR Green實時熒光PCR反應體系，加入上下游引物的終濃 度均為100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直徑0.5mm的紙片加入體系，終體積為20uL; 熒光PCR直接擴增:使用熒光定量PCR儀進行擴增，擴增反應條件為，95°C 2min，[95°C 10s，51°C 20S，72°C 40S(熒光采集）]35次循環，72°C lOmin; PCR擴增效果評價:熒光PCR產物合格的標準為Cp(或Ct)值小于30且熔解曲線顯示有一 個或多個明顯主峰為合格，沒有峰或全部峰Tm值<76°C為擴增產物不合格； 3) 測序PCR反應 如果熒光PCR擴增產物合格，將PCR產物依據Cp值大小稀釋5-10倍，取已稀釋的產物lul 置于PCR管中，再加4ul BigDye Terminator ν3·1 Sequencing Buffer (5X),測序引物 (上游或下游引物）的終濃度為1 OOng/uL，終體積為1 OuL，使用梯度PCR儀進行擴增； 擴增條件為:98°C 2min，（96°C 10S，50°C 5s，60°C 4min)25次循環； 4)產物純化、毛細管電泳和序列讀取、分析和比對 在96孔板中加入產物luL，SAM solution 9uL，BigDye XTerminator solution 2uL; 震蕩5min，2000g離心2min，蓋上測序用硅膠封蓋，用基因分析儀進行毛細管電泳，電 泳完畢機器自動根據測序譜圖并進行序列讀取，可獲得目標片段基因序列； 分析經毛細管電泳后比對測序譜圖及數據，沒有重疊峰的直接讀取序列，使用NCBI網 站上的"nucleotide blast"功能進行序列比對，數據庫選用"Nucleotide collection (nr/nt)"，選取比對結果匹配率最高的一項(一般為首項)作為最終的細菌鑒定結果;有重 疊峰的人工辨認重疊起始處往后兩種序列各15個bp的測序結果，以序列比對和詳圖分析結 果獲得最終鑒定及分型結果;根據測序結果及譜圖的綜合分析情況，可將銅綠假單胞菌分 為a-g共7種亞型。
【專利摘要】本發明涉及一種基于23S-5S？rRNA基因測序譜圖分析法的銅綠假單胞菌分型鑒定方法，使用該方法不僅可以準確鑒定銅綠假單胞菌，還可以進行分子分型。針對銅綠假單胞菌的23S-5S？rRNA基因序列設計特異性引物，應用FTA卡-SYBR？Green？I熒光PCR直接擴增該片段，再將PCR產物簡單稀釋后進行測序反應，分析經毛細管電泳后比對測序譜圖及數據，沒有重疊峰的直接讀取序列，以序列比對和詳圖分析結果獲得鑒定及分型結果，采用此方法，銅綠假單胞菌可分成a-g共7種分子亞型。本發明提供的試劑和方法可對銅綠假單胞菌的23S-5S？rRNA基因進行正確測序，以序列比對和詳圖分析結果獲得最終鑒定及分型結果，結合免費的公共基因數據庫檢索和7種亞型典型測序譜圖，可準確地鑒定這種病原菌并進行分子分型。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號】CN105671141
【申請號】
【發明人】蔡穎, 陳霖祥, 吳烽, 許逸緬, 周霓, 黃琦容, 周廣彪, 魏銳, 朱俊賢, 林昆
【申請人】汕頭國際旅行衛生保健中心
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年4月30日