-MGB-3 '
[0047] 突變型探針：5 ' -HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB-3 '。
[004引所述的一種檢測人類C0X-1基因位點多態性的試劑盒，還包括化qDNA聚合酶、dNTP 混合液、MgCl2溶液、巧光定量PCR反應緩沖液和去離子水。
[0049] 所述的野生型特異性巧光探針為化qman探針，該探針5'端的巧光基團為FAM，3'端 的澤滅基團為MGB。
[0050] 所述的突變型特異性巧光探針為化qman探針，該探針5 '端的巧光基團為肥X，3 '端 的澤滅基團為MGB。
[0化1 ] 試劑盒組成
[0052] 試劑盒的配置成份配合配置，使用時僅需加入樣本即可完成實驗配置，此種配置 更為方便快捷，為優選配置。
[0053] 配合反應液成份組成：
[0化4]_
[ο化5]
[0056] 使用試劑盒的操作步驟
[0057] 步驟1:全血細胞裂解液的制備
[0化引取受檢者外周靜脈血30化1，加入70化1細胞裂解液，顛倒混勻5次，12000rpm離屯、1 分鐘，倒去上清，并將離屯、管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，確保沉淀在管中，加入30化 1雙蒸水，滿旋震蕩混勻成細胞裂解懸液。
[0059] 步驟2:巧光定量PCR反應
[0060] 巧光定量PCR反應體系總體積為10μ1，包括:濃度為20ngAil的細胞裂解懸液化1、 濃度為lOliM的特異性引物共0.45μ1，其中正義引物和反義引物各0.22化1;濃度為扣Μ的特 異性巧光探針共0.化1，其中野生型探針和突變型探針各0.化1;濃度為5單位/μ1的化q DNA 聚合酶0.02μ1;濃度為20mM的dNTP混合液0.化1;濃度為25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定 量PCR反應緩沖液化1;去離子水4.73μ1。
[00川在ΑΒΙ 7500型巧光定量PCR儀上進行反應，反應條件為：50°C下2min，95°C下 lOmin，再進行40~55個PCR循環(92°C下15s，57 °C下Imin)，反應結束后在ABI 7900HT型巧 光定量PCR儀讀取巧光量。
[0062] 步驟3:基因型分析及確定基因型
[0063] 采用ABI 7500型巧光定量PCR儀自帶軟件SDS(Sequence Detection Systems) V2.0,根據檢測反應管中的FAM巧光和皿X巧光PCR曲線，判斷PEARl基因上rs2768759號和 rsl2041331兩個基因位點的分型，分型的具體依據見下表。
[0064] PEAR1基因上rs2768759號和rsl2041331兩個SNP位點分型依據
[00 化]
[0067] 如圖1所示，巧光定量PCR擴增曲線僅FAM巧光起線，皿X巧光不起線，為PEAR1基因 上rs2768759號SNP位點純合野生型。
[006引如圖2所示，巧光定量PCR擴增曲線FAM和皿X 2條巧光都起線，為PEAR1基因上 rs2768759號SNP位點雜合型。
[0069] 如圖3所示，巧光定量PCR擴增曲線僅僅皿X巧光起線，FAM巧光不起線，為PEAR1基 因上rs2768759號SNP位點純合突變型。
[0070] 如圖4所示，巧光定量PCR擴增曲線僅FAM巧光起線，皿X巧光不起線，為PEAR1基因 上rsl2041331號SNP位點純合野生型。
[00川如圖5所示，巧光定量PCR擴增曲線FAM和皿X 2條巧光都起線，為PEAR1基因上 rsl2041331號SNP位點雜合型。
[0072] 如圖6所示，巧光定量PCR擴增曲線僅僅皿X巧光起線，FAM巧光不起線，為PEAR1基 因上rsl2041331號SNP位點純合突變型。
[0073] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運里無需也無法對所有的實施方式予W窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變 動仍處于本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在 于:所述盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號和rsl2041331兩個SNP位點的 特異性引物及特異性熒光探針、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應 緩沖液和去離子水； 所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為： 正義引物:5 ' -CCACCCTCAGCCCTATCACT-3 '， 反義引物:5 ' -AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3 ' ； 所述PEAR1基因上的rsl2041331號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探 針，它們的序列為： 野生型探針：5 ' -FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3 ' 突變型探針：5 ' -HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3 ' ； 所述PEAR1基因上的rsl2041331號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列 為： 正義引物：5 ' -GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3 '， 反義引物:5 ' -GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3 ' ； 所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針， 它們的序列為： 野生型探針:5 ' -FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3 ' 突變型探針:5 ' -HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB-3 '。2. 如權利要求1所述的一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，分別檢測rs2768759 號和rsl2041331兩個SNP位點，其特征在于:所述盒體中各物質的含量為:濃度為ΙΟμΜ的特 異性引物共0.45μ1，其中正義引物和反義引物各0.225μ1;濃度為5μΜ的特異性熒光探針共 0.2μ1，其中野生型探針和突變型探針各0 . ΙμL;濃度為5單位/μL的Taq DNA聚合酶0.02μ1; 濃度為20mM的dNTP混合液0. ΙμL;濃度為25mM的MgC12溶液0.5μ1; 5Χ熒光定量PGR反應緩沖 液2μ 1;去離子水4.73μ 1。3. 如權利要求1所述的一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，其特征在于:所述檢 測rs2768759號位點特異性引物中，正義引物的Tm值為58.4°C，反義引物的Tm值為58.3°C; 所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為69°C，突變型探針的Tm值為68°C ;所述檢測 rsl2041331號位點特異性引物中，正義引物的Tm值為58.7°C，反義引物的Tm值為59.1°C ;所 述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為66°C，突變型探針的Tm值為66°C。4. 如權利要求1所述的一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒的保存溫度為-20 °C。5. -種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒的應用，其物征在于:所述試劑盒用于檢測 PEAR1基因上rs2768759號和rsl2041331兩個SNP位點的基因型。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用。本發明盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點的特異性引物及特異性熒光探針、rs12041331號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq？DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。本發明克服了過去基因突變檢測的諸多方法中各自存在的缺陷。本發明檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，能夠對PEAR1基因rs2768759號和rs12041331號兩個多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，提高效率降低檢測成本，無需DNA提取，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完成擴增。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671142
【申請號】
【發明人】徐運, 邵淵, 張希根
【申請人】南京仁天生物科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年9月10日