后抱子放入1.5ml離屯、管中，加入400μ1 API和4μ1 Rnase，滿 旋混勻；
[0045] S04.S03步驟混勻后的溶液于65°C，解育lOmin;
[0046] S05.加130μ1 AP2,混合后冰浴5min;然后在14000巧m條件下離屯、5min;
[0047] S06.吸取S05離屯、處理所得上清于QIAshredder spin column中的收集管，在 14000巧m條件下，離屯、2min;
[004引S07.將離屯、管中上清液移至新管（勿攬動出現的殘渣），加入1.5倍體積的AP3/E， 移液器混合；
[0049] S08.將650μ1 混合液移至Dneasy Mini spin column中，4200rpm，離屯、Imin;剩下 的液體重復此步驟；
[0050] S09.將spin colum放入新收集管中，加入500ul buffer AW，4200rpm，離屯、Imin; 棄上清；
[0051] S010.再加入500μ1 AW，14000巧 m，離屯、2min;
[0化2] soil.移收集管至1.5ml或2ml離屯、管中；
[0053] S012.加入40μ1 buffer AE洗脫，室溫放置5min;4200巧
[0054] SO 13.重復上一步（即加入40u化uf f er AE洗脫，室溫放置5min，4200rpm條件下離 屯、處理Imin;
[0化5] SO 14.-20 °C冰箱保存備用。
[0056]本發明的有益效果是：
[0化7] 本發明擴展了家蠶微抱子蟲S邱tinl基因 （Accession numbe;r:KF421133.1)序列 的新的應用。本發明通過BLAST軟件進行同源性分析，發現并無相似性序列特異性高，并引 用特異性好的祀基因引物SeptinlF/R;W該引物為參考，Septinl基因為祀基因設計多組 LAMP引物，經過復雜和困難的篩選工作，并對運些引物的有效性、特異性、反應時間等反復 進行了分析、總結和模擬實驗，綜合考慮檢測方法的各種影響因素，才確定所述適用于家 蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測的檢測引物。在只有四條特異性引物完全識別祀基因的6個區 域的情況下，才能進行擴增，從而保證了其對家蠶微抱子蟲Septinl基因擴增的特異性和檢 測的全面性。
[0058] 基于引物的特異性，本發明本進一步對反應體系進行優化，提供了一種家蠶蠶卵 微抱子蟲的LAMP快速檢測方法，能夠檢測濃度為1.2Xl(T4ngAil的微抱子蟲DNA，檢測的靈 敏性與PCR相當，但操作步驟大大簡化，整個反應可在40~90min內完成，大大縮短了檢測時 間，而且不需要價格昂貴的擴增儀器。
[0059] 更進一步的是，本發明基于同一組檢測引物的檢測方法的結果判斷可W有多重選 擇，且結果均易于觀察判定。可在反應產物中加入顯色液，通過直觀的顯色反應就可W肉眼 鑒別檢測;可通過瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳條帶可W更加直觀的觀察反應結果，具有強有 力的說服力，對于假陽性檢測結果也可W輕易地排除掉;可通過實時巧光檢測，可W通過擴 增曲線直觀的判斷結果，且對于濃度高的樣品結果的判定可W提前結束，減少了不必要的 時間浪費。
[0060] 綜上所述，本發明所述的家蠶病原微抱子蟲的LAMP快速檢測方法，操作簡單、不需 要復雜的儀器及復雜的擴增程序、雜質對擴增的干擾較小且反應結果易于判定，特異性強， 為應用LAMP技術進行家蠶蠶卵微抱子蟲的檢測和保證蠶種的質量提供重要基礎和技術儲 備，能較好地滿足科研院校、蠶種生產單位及蠶種質檢中屯、的檢毒需要，易于大范圍推廣應 用。
【附圖說明】
[0061 ] 圖1 PCR引物及LAMP引物組在S邱tinl基因上的位置示意圖。
[0062] 圖2四條LAMP引物設計的祀基因序列和位置示意圖。
[0063] 圖3兩條PCR引物檢測健康蠶卵和添毒蠶卵的電泳圖。
[0064] 其中，M:DL2000 DNA Marker;l:添毒家蠶蠶卵DNA;2:家蠶微抱子蟲DNA;3:正常家 蠶蠶卵DNA;4:d地2〇。
[0065] 圖4家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照品（重組質粒 SeptinlDNA-pMD)結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測）。
[0066] 其中，M:DL2000 DNA Marker;l~7分別為稀釋l〇6-l〇Dcopies/yl的重組質粒 SeptinlDNA-pMD;8:d地20。
[0067] 圖5家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照品（重組質粒 SeptinlDNA-pMD)結果（顯色法檢測）。
[006引其中，M:DL2000 DNA Marker;l~7分別為稀釋l06-l00copies/yl的重組質粒 SeptinlDNA-pMD;8:d地20。
[0069] 圖6家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照品（重組質粒 SeptinlDNA-pMD)結果(實時巧光法檢測）。
[0070] 其中，M:DL2000 DNA Marker;l~7分別為稀釋l〇6-l〇Dcopies/yl的重組質粒 SeptinlDNA-pMD;8:d地20。
[0071] 圖7家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度家蠶微抱子蟲DNA的靈敏性 結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測）。
[0072] 其中M:DL2000 DNA Marker;l-7分別為：：1.2X10°ngAil、1.2Xl〇-ingAU、1.2X l〇-2ngAU、1.2 X l〇-3ngAU、1.2 X l〇-4ngAU、1.2 X lO-Sng/μΙ、1.2 X lO-Sng/μΙ; 8: (1地2〇。
[0073] 圖8家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度家蠶微抱子蟲DNA的靈敏性 結果(顯色法檢測）。
[0074] 其中M:DL2000 DNA Marker;l-7分別為：：1.2X10°ngAil、1.2Xl〇-ingAU、1.2X l〇-2ngAU、1.2 X l〇-3ngAU、1.2 X l〇-4ngAU、1.2 X lO-Sng/μΙ、1.2 X lO-Sng/μΙ; 8: (1地2〇。
[0075] 圖9家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度家蠶微抱子蟲DNA的靈敏性 結果(實時巧光法檢測）。
[0076] 其中M:DL2000 DNA Marker;l-7分別為：：1.2X10°ngAil、1.2Xl〇-ingAU、1.2X l〇-2ngAU、1.2 X l〇-3ngAU、1.2 X l〇-4ngAU、1.2 X lO-Sng/μΙ、1.2 X lO-Sng/μΙ; 8: (1地2〇。
[0077] 圖10家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同的生產上蠶卵的檢 測結果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測）。
[0078] 其中，M:DL2000 DNA 1曰'1?5';1、2、6、7、8、9、11、13號管分別為帶毒蠶卵，其余為無 毒蠶卵，14號為陽性對照，15號為水對照。
[0079] 圖11家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同的生產上蠶卵的檢 測結果(顯色法檢測）。
[0080] 其中，M:DL2000 DNA 1曰'1?5';1、2、6、7、8、9、11、13號管分別為帶毒蠶卵，其余為無 毒蠶卵，14號為陽性對照，15號為水對照。
[0081] 圖12家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同的生產上蠶卵的檢 測結果(實時巧光法檢測）。
[0082] 其中，M:DL2000 DNA 1曰'1?5';1、2、6、7、8、9、11、13號管分別為帶毒蠶卵，其余為無 毒蠶卵，14號為陽性對照，15號為水對照。
[0083] 圖13用MEGA5.1軟件構建家蠶微抱子蟲Septins系統進化N-J樹。
【具體實施方式】
[0084] 下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明。下述附圖和實施例僅用于示例性 說明，不能理解為對本發明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規市購或 商業途徑獲得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規使用 的方法和設備。
[0085] 實施例1引物的設計和篩選
[0086] 本發明W通過轉錄組測序方法并通過克隆測序方法驗證的家蠶微抱子蟲S邱tinl 基因 （Accession number :KF421133.1)序列，通過BLAST軟件進行同源性分析，發現并無相 似性序列，因此W該基因為祀基因設計SeptinlF/R引物。圖1顯示的是PCR引物及LAM巧I物 組在Septinl基因上的位置示意圖。圖2所示為四條LAMP引物設計的祀基因序列和位置示意 圖。
[0087] ①引物組1四條引物序列為：
[0088] Septinl