min觀察結果。
[01；35] (5)結果判定：
[0136] ①染色法:將反應管管蓋內側的顯色液彈入反應管，與反應產物混合;在自然光下 通過肉眼觀察顏色變化，反應產物顏色變為綠色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微抱子蟲;反 應產物變為澄色，則不含有家蠶蠶卵微抱子蟲。
[0137] ②瓊脂糖凝膠電泳法：取化L反應后的產物，與ΙμΙ 6X loading buffer和化 Ld地20混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳;若出現大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品含有 家蠶蠶卵微抱子蟲;若無大小不等的梯形條帶出現，說明待測樣品不含有家蠶蠶卵微抱子 蟲。
[0138] ③實時巧光法:若有"S"型擴增曲線且擴增值超過設定的闊值為陽性，若擴增曲線 擴增值未超過設定的闊值則為陰性。
[0139] 圖3所示為兩條PCR引物檢測健康蠶卵和添毒蠶卵的電泳圖。其中，M:DL2000 DNA Marker; 1:添毒家蠶蠶卵DNA; 2:家蠶微抱子蟲DNA; 3:正常家蠶蠶卵DNA; 4: d地2〇。由附圖3 可見，結果顯示純化的家蠶微抱子蟲基因組DNA和感染家蠶微抱子蟲蠶卵DNA出現特異性擴 增即S邱tinlF/R擴增出大小為699bp的特異條帶，而家蠶蠶卵DNA與ddH20均無特異性擴增 結果
[0140] 圖4至圖6所示為家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照品（重 組質粒SeptinlDNA-pMD)，圖4為瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果，圖5為顯色法檢測結果，圖5中 1-4號顯示為綠色，5-8號顯示為澄色；圖6為實時巧光法檢測結果。其中，M:DL2000 DNA ]\1曰'1<：6。1~7分別為稀釋106-10〇(3〇口16 3/41的重組質粒5邱1:;[]110魁-口]\0);8:(1地2〇。由附圖4 至6可見，sepll引物組在該擴增體系下分別可W檢測到的最低重組質粒SeptinlDNA-pMD 濃度為 l〇3copies。
[0141] 圖7至9所示為家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度家蠶微抱子蟲DNA 的靈敏性結果。圖7為瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果，圖8為顯色法檢測結果，圖8中1-5號顯示 為綠色，6-8號顯示為澄色；圖9為實時巧光法檢測結果。其中Μ:化2000 DNA Marker; 1-7分 別為：：1.2 X lOVgAU、1.2 X lO-ing/μΙ、1.2 X l〇-2ngAU、1.2 X l〇-3ngAU、1.2 X l〇-4ngAU、 1.2 X l〇-5ng/yl、1.2 X l〇-6ng/yl;8: d地2〇。由附圖7至附圖9可見，sepl 1引物組在該擴增體 系下分別可W檢測到的最低N.b DNA濃度為1.2 X l(T4ngAiL
[0142] 圖10至圖12所示為家蠶蠶卵微抱子蟲LAMP可視化快速檢測方法檢測不同的生產 上蠶卵的檢測結果。圖10為瓊脂糖凝膠電泳法檢測結果，圖11為顯色法檢測結果，圖11中， 1、 2、6、7、8、9、11、13、14號顯示為綠色。圖12為實時巧光法檢測結果。其中，]?:01^2000 0魁 Marker; 1、2、6、7、8、9、11、13號管分別為帶毒蠶卵，其余為無毒蠶卵，14號為陽性對照，15號 為水對照。由附圖10至附圖12可見，sepll引物組在該擴增體系下可W檢測到陽性樣品及1、 2、 6、7、8、9、11、13號生產樣品，即該方法檢測結果正確效果好。
[0143] 圖13所示為用MEGA5.1軟件構建家蠶微抱子蟲S邱tins系統進化N-J樹，結果顯示 Septinl基因在家蠶微抱子蟲中特異性高。
【主權項】
1. 一種適用于家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物，其特征在于，所述引物為Sept inl-F3、S印tinl-B3、S印tinl-FIP和S印tinl-BIP，其序列分別如SEQ ID N0:1 ~4所示。2. -種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：51. 提取待測樣品模板DNA;52. 基于權利要求1所述的檢測引物，配置反應體系；53. 在步驟S2所配置的反應體系使用的反應管中加入20yL密封液，在管蓋內側加入lyL 顯色液；54. 反應:將反應管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設備中，63 °C恒溫放置60min;然后95 。(：，放置2min滅活；55. 結果判定： 采用染色法進行結果判定:將反應管管蓋內側的顯色液彈入反應管，與反應產物混合； 在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應產物顏色變為綠色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵 微孢子蟲;反應產物變為橙色，則不含有家蠶蠶卵微孢子蟲； 或者采用瓊脂糖凝膠電泳法進行結果判定：取2yL反應后的產物，與lyL 6 X loading buff er和8yLddH2〇混合，于2 %瓊脂糖凝膠電泳;若出現大小不等的眾多梯形條帶，說明待 測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲;若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不含有家蠶 蠶卵微孢子蟲； 或者采用實時熒光法進行結果判定:若有"S"型擴增曲線且擴增值超過設定的閾值為 陽性，若擴增曲線的擴增值未超過設定的閾值則為陰性。3. 根據權利要求2所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，其特征在于，S2所述的 反應體系是采用優化后的25yL反應體系，分別如下： 采用染色法進行結果判定的25yL反應體系為：采用實時熒光法進行結果判定25yL反應體系為：采用瓊脂糖凝膠電泳法進行結果判定25yL反應體系為：4. 根據權利要求3所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，其特征在于，所述2X Reaction Mix為反應緩沖液，組成為20mMTris-HCl，pH8 · 8; lOmMKCl; 2mMMgS〇4; 20mM(NH4) 2SO4; 0 · 1 % Triton X-100; 2 · 8mMdNTPs; 1M甜菜堿；25mMMgCl2; 所述36口1:;[111-?3/133為5。111〇1/^1^;所述36。1:;[111-?1?/131?為20~4(^111〇1/^1^;所述 BstDNApolymerase為8U/yL〇 陽性對照品為Sept in lDNA-pMD重組質粒。5. 根據權利要求3所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，其特征在于，所述顯色 液為10000 XSYBR Green I;所述熒光指示劑為IX SYBR Green I。6. 根據權利要求2所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，其特征在于，S1步驟所 述提取待測樣品模板DNA的方法包括以下步驟：501. 取微孢子蟲樣品200μ1，離心，棄上清;加50~100ylddH20重懸得孢子液；502. 吸取S01步驟重懸的孢子液至預冷的研缽中，液氮充分研磨；503. 將S02步驟研磨后孢子放入1.5ml離心管中，加入400μ1 API和4μ1 Rnase，渦旋混 勻； 504. S03步驟混勻后的溶液于65°C，孵育10min;505. 加130μ1 AP2，混合后冰浴5min;然后在14000rpm條件下離心5min;506. 吸取S05離心處理所得上清于QIAshredder spin column中的收集管，在14000rpm 條件下，離心2min;507. 將離心管中上清液移至新管，加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合；508. 將650μ1混合液移至Dneasy Mini spin column中，4200rpm下離心lmin;剩下的液 體重復此步驟；509. 將spin colum放入新收集管中，加入500ul buffer AW，4200rpm下離心lmin;棄上 清； S010 ·再加入500μ1 AW，14000rpm 下離心離心 2min; 5011. 移收集管至1.5ml或2ml離心管中； 5012. 加入40μ1 buffer AE洗脫，室溫放置5min;4200rpm下離心lmin; 5013. 加入40ulbuffer AE洗脫，室溫放置5min，4200rpm下離心處理lmin; 5014. -20°C冰箱保存備用。
【專利摘要】本發明公開了一種適用于家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物及快速檢測方法。所述檢測引物為Septin1-F3、Septin1-B3、Septin1-FIP和Septin1-BIP，其序列分別如SEQ？ID？NO：1～4所示。基于所述引物，本發明優化了檢測步驟和系統，提供一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，操作簡單、不需要復雜的儀器及復雜的擴增程序、檢測耗時短、雜質對擴增的干擾較小，且反應結果易于判定，特異性強，為應用LAMP技術進行家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測和確保蠶種健康無毒提供重要的基礎和技術儲備，能較好地滿足科研院校、蠶種生產單位及蠶種質檢中心的檢毒需要，易于大范圍推廣應用。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105671144
【申請號】
【發明人】劉吉平, 楊思佳, 程偉
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年11月6日