-F3:5' -AAGGTGAAAGGATTMTGACTT-3，；
[0089] Septinl-B3：5'-TCATATAATTCACTTGCTGTGTA-3'；
[0090] Septinl-FIP(Flc+F2)：
[0091] 日'-TCCCCATTTMACTTCCTAACTCGATTCCATTTTTCGTTGTTTCATCT-3';
[0092] Septinl-BIP(Blc+B2)：
[00巧]5，-AAGTTGATAACACGGAACACTGTCAAAACACTTAAATGTGTACCAA-3，；
[0094]②引物組2四條引物序列為：
[00 巧]2F3:5，-TCAAAAATAAGGAGAGATCCTAC-3，；
[0096] 2B3：5'-TCACTAAGCTGATTTCGTACT-3'；
[0097] 2FIP：
[009引 5'-CTGTTTCTTTCAGACCATTCACAGTAGATACAAGAGTCCATTGTCT-3'；
[0099] 2BIP：
[0100] 5'-TCTCTTGTAAATATTGTGCCTGTCACTTTCAGAATTGTTCTCTCGA-3'；
[0101] ③引物組3四條引物序列為：
[0102] 巧3:5 '-GAAGAATCAAAAATAAGGAGAGATC-3 '；
[0103] 1B3：5'-TCACTAAGCTGATTTCGTACT-3'；
[0104] 1FIP：
[0105] 5'-AGACCATTCACAGTTGAAGGTATGCTACTTTTGAAGATACAAGAGTCC-3'
[0106] 1BIP：
[0107] 5'-TCTCTTGTAAATATTGTGCCTGTCACTTTCAGAATTGTTCTCTCGA-3'〇
[0108] 使用上述PCR引物檢測健康蠶卵和感染了家蠶微抱子蟲的蠶卵，結果顯示該引物 對于家蠶蠶卵微抱子蟲的檢測具有特異性，因此基于該PCR引物擴增片段位置，WSeptinl 基因為LAMP引物設計的祀基因，使用在線軟件Primer Explore;rV4(http:// primere邱lorer. jp/elamp4.0.0/index.html)，設計多組LAMP引物，經過復雜和困難的篩 選工作，并對運些引物的有效性、特異性、反應時間等反復進行了分析、總結和模擬實驗，綜 合考慮檢測方法的各種影響因素，確定一組即四條特異性引物作為LAMP檢測用引物。
[0109] 實施例2家蠶蠶卵及家蠶蠶卵微抱子蟲的模板DNA的制備
[0110] 取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微抱子蟲的家蠶所產蠶卵樣品10~50粒，12000rpm下 離屯、5min，棄上清;然后加50~10化1 d地2〇重懸;吸取重懸的抱子液至預冷的研鉢中，液氮 充分研磨（3次W上）；將研磨后抱子放入1.5ml離屯、管中，加入40化1 API(參見Qiagen公司 出品的試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明，W下其他試劑同）和化1化ase，滿旋混勻）；混 勻后的溶液，65°C，解育lOmin(期間上下顛倒試管2~3次）；加13化1 AP2,混合后冰浴5min; 然后HOOOrpm下離屯、5min;吸取上清于QIAshredder spin column中的收集管，14000rpm離 屯、2min;將離屯、管中上清液移至新管（勿攬動出現的殘渣），加入1.5倍體積的AP3/E，移液器 混合;將65化1混合液移至化easy Mini spin column中，420化pm,離屯、Imin;剩下的液體重 復此步驟;將spin colum放入新收集管中。加入500ul buffer AW(參見Qiagen公司出品的 試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明），4200;rpm，離屯、Imin;棄上清；再加入500μ1 AW, 14000rpm，離屯、2min;(保證收集管不接觸到底部上清）；移收集管至1.5ml或2ml離屯、管中； 加入40μ1 buffer AE(參見Qiagen公司出品的試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明）洗脫， 室溫放置5min; 420化pm，Imin;重復上一步;-20°C冰箱保存備用。
[0111] 實施例3制備陽性對照品：
[0112] 用上游引物SeptinlF和下游引物SeptinlR為反應引物，W家蠶微抱子蟲DNA為模 板進行PCR擴增，擴增產物克隆入PMD-19T(購自Takara公司）載體獲得S邱tinlDNA-pMD質粒 并作為檢測的陽性模板。
[0113] S邱tinlF和下游引物S邱tinlR的序列為：
[0114] SeptinlF：5'-TCATCATTCTTTAATACACTC-3'；
[0115] SeptinlR：5'-CTTCTCATATAATTCACTTGC-3'；
[0116] 用引物組S邱tinl-F3和S邱tinl-B3作為外部引物，Seiptinl-FIP和S邱tinl-BIP作 為內部引物，反應緩沖液2XReaction Mix(20mM Tris-HCl，p冊.8;10mM KCl;2mMMgS〇4; 20mM(NH4)2S〇4;0.1%Triton X-100;2.8mM dNTPs;lM甜菜堿；25mM MgCl2);SeptinlF3/B3 (20~40pmol/yL) ;SeptinlFIP/BIP(5pmolAiL);陽性對照品；Bst DNA polymerase(洲/μ L);密封液；顯色液（10000 XSY服Green I);巧光指示劑（IX SYBR Green I);滅菌dd此0; 即為家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測方法的所有檢測試劑。
[0117] 實施例3應用試驗
[0118] 本實施例提供家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測方法的應用試驗，操作步驟如 下：
[0119] (1)制備待測樣品核酸(QIAGEN 歴easy plant mini kit):
[0120] 取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微抱子蟲的家蠶所產蠶卵樣品10~50粒，12000rpm， 離屯、5min，棄上清;然后加50~10化1 d地20重懸;吸取重懸的抱子液至預冷的研鉢中，液氮 充分研磨(3次W上）；將研磨后抱子放入1.5ml離屯、管中，加入40化1 API和化1化ase，滿旋 混勻）；混勻后的溶液，65°C，解育lOmin(期間上下顛倒試管2~3次）；加13化1 AP2(參見 Qiagen公司出品的試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明），混合后冰浴5min;然后HOOOrpm 離屯、5min;吸取上清于QIAshredder spin colu皿中的收集管，14000;rpm離屯、2min;將離屯、 管中上清液移至新管（勿攬動出現的殘渣），加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合;將65化1 混合液移至化easy Mini spin colu皿中，420化pm離屯、Imin;剩下的液體重復此步驟;將 spin colum放入新收集管中。加入500ul buffer AW，4200;rpm，離屯、Imin;棄上清；再加入 500μ1 AW，1400化pm離屯、2min(保證收集管不接觸到底部上清）；移收集管至1.5ml或2ml離 屯、管中；加入40μ1 buff er AE洗脫，室溫放置5min; 4200rpm，Imin;重復上一步；-20°C冰箱 保存備用。
[0121] (2)配置反應體系：
[0122] ①染色法判定結果
[0123] 在PCR管中配置，采用優化后的SSliL反應體系，如下表所述：
[0124]
[0125] 建議:對于N個樣品，應配制(N+3)倍體積的反應液(包括陰性對照、陽性對照各一 個，W及分裝耗費誤差），保證各反應管分裝均勻。
[01%]②實時巧光法判定結果
[0127]在PCR管中配置，采用優化后的SSliL反應體系，如下表所述：
[012 引
[0129] ③瓊脂糖凝膠電泳法判定結果
[0130] 在PCR管中配置，采用優化后的SSliL反應體系，如下表所述：
[0131]
[0132]
[0133] (3)加樣：分裝后，分別依次向反應管加入化L的cW此0(空白對照）、各模板DM、陽 性對照品；然后加入甘油20化密封；（對于染色法判定結果，要在反應管管蓋內側加入化L顯 色液，將管蓋蓋緊(注意避免顯色液掉入反應液中）。
[0134] (4)反應:對于染色法和瓊脂糖凝膠電泳法判定結果的檢測，將反應管置于恒溫水 浴箱或其他恒溫設備中，63°C恒溫放置60min，然后95°C，放置2min滅活。對于實時巧光法判 定結果的檢測，將反應管放入Deaou-308C恒溫巧光檢測儀或其他巧光檢測儀中，63°C恒溫 放置90