用于連接和釋放遺傳物質，特別是dna/rna，的新型聚乙烯亞胺-基共聚物及其制備方法和用圖
【專利說明】用于連接和釋放遺傳物質，特別是DNA/RNA，的新型聚乙稀亞 胺-基共聚物及其制備方法和用途
[0001] 本發明設及由乙締亞胺單元和2-嗯挫嘟單元構成的新型聚乙締亞胺-基共聚物， 但是與已知的聚乙締亞胺-基共聚物(PEI)相比，本發明的聚乙締亞胺-基共聚物令人驚奇 地具有高官能度。運種類型的聚乙締亞胺-基共聚物已知用于連接和釋放DNA/RNA。而且，本 發明還包括本發明提出的聚乙締亞胺-基共聚物的制備方法和特定功能的用途。
[0002] 本發明提出的的聚乙締亞胺-基共聚物可用于，例如，將表面官能化，開發用于移 動分析的DNA忍片系統和用作傳感器的防污涂料。
[0003] 2-(3-下締基）-2-嗯挫嘟已知用作單體（A.Gress , A. V別kel，H. Schlaad; Thio- click modification of poly[2-(3-butenyl)-2-oxazoline]Macromolecules 40,2007, 7928-7933) ,2-( 3-下締基）-2-嗯挫嘟是通過用N-班巧酷亞氨基-4-戊酸醋（N- succinimidyl-4-pentenate)將(2-氯乙基胺)-氨氯化物官能化，然后進行閉環制得的。使 在Ξ個步驟中制得的單體2-(3-下締基）-2-嗯挫嘟聚合，得到聚（2-(3-下締基）-2-嗯挫 嘟）。運種比較耗時的方法得到的均聚物不包含連接遺傳物質(特別是DNA/RNA)所需的游離 氨基。
[0004] 通過所謂的邁克爾反應(Michael reaction)來實現用N-異丙基丙締酷胺將聚乙 締亞胺-基共聚物官能化也是已知的（H.Tian,F.Li,J.Chen,Y.Huang,X.Chen:N- Isopropylacrylamide-modified Polyethyleneimines as Effective Gene Carriers, Macromolecular .Bioscience 12,2012,1680-1688)。運些合成的衍生物對質粒DNA顯不出 粘合力(bonding affinity)。然而，通過所述邁克爾反應將PEI官能化得到側鏈，但是側鏈 沒有可能的多重鍵，因此官能化是有限的。特別地，W運種方式不可能制備具有官能化表面 的基底或結構化水凝膠，例如對于珠粒和顆粒等，從而用于連接和釋放遺傳物質。
[000引也已知在溫和的條件下，N-徑基班巧酷胺(NHS)或極性稍微更大的N-徑基班巧酷 胺(NHS)與含簇基的組分（例如，下酸）反應，得到"氨基酷基醋"（D.Sehgal，I.K.Vijay:A method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation,Anal.Biochem.218,1994,87-91)。
[0006] 通過運些氨基酷基醋，可W將氨基基團官能化，但是該官能化僅限于伯胺基團。而 且，沒有提及在聚合物中引入官能化的側鏈。如上所述，多重鍵在運里也不可能出現，因此 還是不能制備具有官能化表面或結構化水凝膠的基底，例如，對于珠粒和顆粒等，從而連接 或釋放遺傳物質，特別是DNA/RNA。
[0007] 而且，通過抓AC/NHS用乙酸醋、下酸醋和己酸醋將支化PEI官能化也是已知的 (A.M.Doody,J.N.Korley,K.P.Dang ,P.N.Zawaneh,D. Putnam: Characterizing the structure/function parameter space of hydroc曰rbon-conjug曰ted branched polyethylenimine for DNA delivery in vitro,J.Control.Release 116,2006,227- 237)。如前所述，官能化還是僅限于伯氨基基團。而且，通過乙酸酢、丙酸酢和下酸酢將聚乙 締亞胺官能化也有描述（S.化mesh, A. Aggarwal, P. Kumar, Y. Singh,K. C. Gupta, R. Qian化a: Influence of acyl chain length on transfection mediated by acylated PEI nanoparticles，Int. J.Pharm. 337，2007，265-274)。在運兩種情形中，存在對遺傳物質（例 如DNA/RNA)的粘合力，但是仍然沒有提及引入的側鏈具有多重鍵，因此，上述有限的應用官 能性的缺點仍然存在。
[000引此外，已知具有可調的降解速率的聚亞烷基亞胺水凝膠(M. Carnahan, J. But 1 in: Crosslinked Polyalkyleneimine Hydrogels with Tunable Degradation Rates,WO 2009/102952A2)。運里，通過活化的乙二醇使經過不同的官能化的聚亞烷基亞胺(其反應歷 程沒有經過證實）、或者支化的聚乙締亞胺交聯，從而PEI僅有一部分原始的氨基可用于將 來的生物應用。僅通過起始聚合物的量與交聯劑的量的比率來間接控制交聯度。在該方法 中，重點在于水凝膠網狀結構的合成。沒有進一步討論已有的官能性的后續用途，例如用在 表面上，或者用于合成用于連接和釋放遺傳物質的結構化水凝膠。
[0009] 此外，已知聚（N-乙酷基乙締亞胺）的部分堿性水解（Y. Chujo , Y. Yoshifu ji， Κ.Sada,Τ.Saegusa:A Novel Nonionic Hydrogel from 2-2-methy1-2-oxazoline, Macromolecules 22,1989,1074-1077)。只有通過已有的乙締亞胺單元才可能發生上文已 經描述的隨后交聯形成聚合物網狀結構。運些不再可用于連接遺傳物質和W后釋放遺傳物 質。在制得的水凝膠中，不能準確量化游離的乙締亞胺單元。而且，沒有提及在聚合物中引 入官能化的側鏈，因此，排除例如表面官能化的應用。在水解方法中不能引入具有不飽和官 能性的側鏈。
[0010] 聚乙締亞胺的烷基化或者酷化和對從運些共聚物釋放的質粒的分析是公知的 (M.Thomas,A.Μ.ΚΙibanov:Enhancing polyethylenimine's delivery of plasmid DNA into mammalian cells，PNAS 99,2002，14640-14645)。運里仍然沒有提及引入不飽和官能 團和通過交聯劑將共聚物轉化成水凝膠的可能性。
[0011] 而且，詳細具體地分析了通過乙酸酢將聚乙締亞胺部分乙酷化(M丄.Forrest, G.E.Meister,J.T.Koerber,D.W.Packl:Partial Acetylation of Polyethylenimine Enhances In Vitro Gene DeliveiT,Pharm.Res.21,2004,365-371)。由于側鏈缺乏多重 鍵，仍然存在限制可能的用途的上述缺點。
[0012] 也提及了用單官能、雙官能或多官能組分使支化的聚乙締亞胺官能化和交聯。 (P.Tarcha,T.Mercian,E.Wagner,J. Klocks胤仰emically modified polycation polymer for siRNA delivery,WO 2007/084797)。提及了通過邁克爾反應引入不飽和官能團的可能 性，但是沒有進一步描述實際實施。因此，運里也沒有提及可能應用運些聚合物的W下可能 應用：用于表面官能化或水凝膠的結構化，例如對于珠粒和顆粒等，從而用于連接和釋放遺 傳物質(特別是DNA/RNA)。而且，在共聚物中通過交聯劑連接已有的潛在的乙締亞胺單元。 [OOU] 也已知用長鏈酸性面化物進行官能化化.Yan，W . T . S . Huck，X . -M . Zhao， G.Μ.Whitesides:Patterning Thin Films of Poly(ethylene imine)(L.Van,WTS Huck, X.-M Zhao,GM Whitesides.Patterning Thin Films of poly(ethylene imine)on a Reactive SAM Using Microcontact Printing,Langmuir 15,1999,1208-1214)，但是仍然 存在側鏈缺失多重鍵和相關的應用可能性的缺點。
[0014]已知合成具有各種組成的水溶性共聚物(W0 2011/162366 A1)。僅在側鏈的乙二 醇單元的上下文中描述了在支化的聚乙締亞胺中引入多重鍵，其目的是合成水溶性聚合 物。遺傳物質的化學連接極大地受限于正電荷密度降低的百分比，特別是對于長的側鏈。期 望的溶解性特性特別是通過大數目的乙二醇單元實現的，但是，運導致難w連接，特別是難 W連接DNA。但是，為了能夠觀察到對遺傳物質的最有效連接，共聚物中的乙締亞胺比例必 須達到某個數量級。但是，從該組成出發，水溶性變得不再可能。沒有提及運些不飽和的官 能化共聚物例如用于水凝膠的結構化的應用。
[0015] 而且，已知聚（2-嗯挫嘟）的部分水解（F.Wiesbrock，F.Stelzer，C.Slugovic, N.Noormofidi,V.Kaltenhauser,E.Kreutzwiesner,K.Rametsteiner:Use of contact biocides based on poly(2-substi1:uted)oxazolines,WO 2012/149591)。采用該反應方 法不可能合成含有多重鍵的共聚物。水解導致在所需條件下破壞多重鍵的官能性。
[0016] 因此，本發明的目的是創造一種新型聚乙締亞胺-基共聚物，可W低成本并且耗時 短地來制備所述共聚物，所述共聚物是特制的（tailor-made),并且對于對于廣泛有效的用 途具有高官能性，但是運并不限制它們連接遺傳物質(特別是DNA/RNA)的能力。
[0017] 例如，可W由聚（乙締亞胺)-基共聚物制備對DNA/RNA具有高粘合力的水凝膠。
[0018] 該目的通過用于連接和釋放遺傳物質的新型聚乙締亞胺-基共聚物來實現，所述 遺傳物質特別是DNA/RNA，所述聚乙締亞胺-基共聚物由乙締亞胺單元和2-嗯挫嘟單元構 成，所述聚乙締亞胺-基共聚物具有通式I的化合物：
[0019]
[0020] 其中，
[0021] a、b:各單體單元的比例(a、b〉0)，
[0022] d:側鏈的長度（1-20)，
[0023] X:2-嗯挫嘟單元官能團(經由雙鍵或Ξ鍵），
[0024] 共聚物鏈長為2-1000000個單元。
[0025] 運里，如果運些新型聚乙締亞胺-基共聚物具有根據通式II的不同的嗯挫嘟單元 會是有利的：
[0026]
[0027]其中，
[002引 a、b、c:各單體單元的比例(a、b、c〉0)，
[00巧]d:側鏈的長度（1-20)，
[0030] X:2-嗯挫嘟單元官能團(經由雙鍵或Ξ鍵），
[0031] R:H或有機基團（例如，烷基和芳基基團），
[0032] 共聚物鏈長為2-1000000個單元。