>[0033] 可W通過核磁共振譜W簡單快速的方式確認所述特制（tailored)共聚物的組成。 與現有技術相比，所述新型共聚物的結構允許在共聚物主鏈中具有多重鍵，因此為官能性 創造了條件，而不會限制對遺傳物質的粘合力。因此，所述官能性允許充分支持連接/釋放 (特別是連接/釋放DNA和RNA)的其他應用。例如，可W通過本身稱為點擊化學（click- chemishy)的手段（硫醇-締光加成（thiol-ene photo addition)，疊氮化物點擊（azide click))向所述共聚物中添加另外的組分。制得的共聚物的一大優點是該反應不會影響已 有和準確量化的氨基基團。因此，它們的連接和釋放遺傳物質的親和力(affinity)也保持 不受影響，并且通過調節共聚物中的PEI含量仍然可W對其產生影響。重點仍然在于引入對 生物應用沒有影響的又短又簡單的側鏈，因此允許定量描述與遺傳物質的連接。
[0034] 在從屬權利要求中，基于本發明提出的共聚物的上述官能性說明了運些共聚物的 特定應用。例如，所述共聚物可W應用于經官能化的表面，允許在運些表面中連接和釋放遺 傳物質。由于不完全的表面連接，存在游離的多重鍵，運些多重鍵可用于在期望的表面逐漸 產生水凝膠層。另一個優點是將Ξ維聚合物網狀結構(所謂的水凝膠)結構化的可能性。借 助于雙官能連接劑(二硫基化合物），共聚物可W交聯形成運種水凝膠。運種聚合物網狀結 構的關鍵優點在于它們在所有溶劑中的絕對的不溶性。因此，不可能(像在共聚物的情形中 那樣)通過(溶液)核磁共振譜確定凝膠結構中的所述PEI含量。但是，基于上述對共聚物的 表征W及隨后通過不飽和官能團（氨基基團保持不受影響)交聯，可W準確描述水凝膠中包 含的陽I比例。
[0035] 例如，通過用UV光(365nm)福照樣品來簡單快速地進行硫醇-締光加成，也提供了 原位定制(州stomized)水凝膠珠粒可能性。運里，也可W選擇性地連接和釋放遺傳物質。
[0036] 根據本發明，通過通式ΙΠ 的合成來制備新型聚乙締亞胺-基共聚物：
[0037]
[003引在-OH或-NHS作為酸的情況下，在活化劑的存在下引入官能化是有利的，所述活化 劑特別是邸C(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)或DCC(二環己基碳二亞胺）。
[0039] 但是，也可W通過采用不飽和酸酢或面化物(-C1、-化、-I)的在后官能化來引入功 能性側鏈。
[0040] 歸因于合成方法，本發明的共聚物同時具有不飽和官能性和游離氨基基團。根據 本發明，式I或式II的共聚物的合成基于將均聚物聚乙締亞胺在后官能化(式III)。
[0041] 所述合成方法允許W低成本進行節約時間和技術簡單的方法，所述方法對于小規 模和大批量技術均可用。制備特制的共聚物所得到的物質具有準確限定的組成，該組成可 W根據具體的應用目的而變化。可W采用核磁共振光譜簡單快速地確定它們的準確組成。 因此，通過簡單改變前體的量就可W創造具有不同組成的廣泛的共聚物庫。
[0042]將通過各種【具體實施方式】來詳細描述本發明。
[00創實施例1:
[0044] W準確可調的PEI比例來合成水凝膠（用于后面連接和釋放基因組（genomic he;r;ring)DNA)，其中W類似于化巧aville所述的方法，通過光引發的硫醇-締光加成來使共 聚物交耳關（TR Dargaville et al. :poly(2-oxazoline)hydrogel monoliths is carried out via thiol-ene coupling,Macromol.Rapid Commun.33,2012 1695-700)。
[0045] 下式示意性地顯示了在1^光(365加1)下，在催化劑01?4的存在下，用2,2/-(乙二基 雙氧代）雙乙硫醇（2,2 '-(ethylenedio 巧）diethanthiol)對 P(Bu1:En0x-c〇-EI)進行硫醇- 締光加成的制備方法。
[0046]
[0047] 聚[2-(3-下締)-2-嗯挫嘟-共-乙締亞胺]基水凝膠:
[004引在微波小瓶中，使共聚物P(Bu巧nOx-co-EI)溶解在乙醇中。在另一個小瓶中，使光 引發劑2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酬和雙官能醇2,2'-(乙二基雙氧代)雙乙硫醇也溶解在 乙醇中（醇:雙鍵為0.9:1.0)。用氮氣將組合的澄清溶液（10重量％)脫氣30分鐘并且暴露于 UV光(365nm)約24小時。開始形成凝膠顯示出成功地合成了水凝膠。用甲醇和水反復洗涂得 到的凝膠。在該方法之后進行冷凍干燥。
[0049]可W由合適的共聚物開始來創造各種水凝膠的庫。也可W廣泛地表征合成的物質 (源值(source value)、氣相了64、尸1'-11?、64、固體1護/1化-醒1?、56]\〇。
[00加]DNA研究-漠乙菲晚測試P(Bu巧nOx-co-EI)基水凝膠:
[0051 ] 使水凝膠在皿G緩沖液(pH 7)中溶脹24小時。然后，添加基因組DNA漠乙菲晚溶液。 W規定的次數，每次取一個等分試樣，在測量巧光之后，將其用移液管移回。通過添加肝硫 醋溶液并且將溫度升高到70°C，在非常短的時間內實現了之前連接的DNA的目標釋放。
[0化2]
[0053] 圖1:通過EB測試的具有不同PEI含量的水凝膠連接(A)和釋放(B)基因組DM的示 意圖
[0054] 結果:
[0化日]僅在陽I含量低于75 %時才發生膠凝。
[0056] 除了具有期望的不溶性，水凝膠在水中表現出典型的溶脹性，運極大地依賴于凝 膠的PEI含量和交聯度(二硫基化合物的量）。連接和釋放DNA的能力取決于水凝膠結構中的 PEI比例。除了溫度升高之外，受控釋放也需要存在肝硫醋。還是在非常短的時間內（<60分 鐘），幾乎全部釋放DNA。
[0057] 實施例2:
[005引類似于懸浮聚合通過硫醇-締光加成配制水凝膠珠粒。
[0059] 通過制備本發明提出的新型共聚物作為水凝膠珠粒，實現了表面積的極大增加， 因此實現了更有效的DNA連接。而且，通過改變反應條件可W將珠粒調節到準確限定的尺 寸。
[0060] P (Bu巧nOx-co-E I)基水凝膠珠粒:
[0061 ]采用共聚物P(Bu巧nOx-co-EI日日％)作為起始原料。使該共聚物和適量的催化劑DMPA 溶解在乙醇(8重量％ )中，然后添加二硫基化合物2,2/-(乙二基雙氧代)雙乙硫醇。通過加 入石蠟油和穩定劑Spmf"80,制得兩相混合物。用化脫氣25分鐘之后，通過在室溫下攬拌 (375rpm)和UV-福照(365皿），進行硫醇-締光加成。2.5小時之后，分離得到的水凝膠并且用 乙醇和水深度清洗。然后，使凝膠在水中溶脹六小時并且進行冷凍干燥。
[006。 實施例3:
[0063] 在經硫醇-締光加成而官能化的玻璃表面上添加單層和逐漸生成共價連接的水凝 膠層。
[0064] 本發明提出的新型共聚物與硫醇-官能化的表面的共價連接使得DNA有效連接表 面和從表面釋放成為可能。通過結合上述二硫基化合物，取決于層厚度，可W逐漸建立具有 不同的DNA親和力的水凝膠層(概述1)。從經涂布的表面連接和釋放遺傳物質(特別是DNA/ RNA)的運一應用可用于，例如，移動分析(忍片診斷）中。
[0065] 在圓錐形的微波小瓶中，使共聚物口(811*611〇義-(3〇斗1日〇%)和光引發劑2,2-二甲氧 基-2-苯基苯乙酬一起溶解在乙醇中。放置預先在等離子體加熱爐中烘烤并且用3-(Ξ甲氧 基甲娃烷基)-1-丙硫醇官能化的IX 1cm2的玻璃板，使得在插入的玻璃板下面仍然可w用 磁力攬拌棒進行攬拌。用氮氣將小瓶脫氣30分鐘，然后將小瓶暴露于UV光（365nm)約24小 時。用水和甲醇反復洗涂經涂布的玻璃表面(第一點擊）。代替添加共聚物，通過添加交聯劑 乙二基雙氧代)雙乙硫醇，W類似的方式進行第二點擊。再次進行上述洗涂步驟。與 所述共聚物重復反應(第Ξ點擊），得到水凝膠層的形態形成(formal creation)。由于存在 游離雙鍵，可W逐步構建層狀結構，直到第屯點擊，并且甚至更多層也是可能的。
[0066]
[0067] 概述1:涂層的化學背景
[0068] 采用巧光顯微鏡可W顯示出成功地涂布了玻璃表面。為了該目的，用巧光素染料 (~1%)標記上述共聚物，然后將W此方式標記的共聚物添加到待檢測表面(點擊步驟）。即 便在深度洗涂之后，與沒有染料的涂層相比經標記的樣品具有增加的巧光，因此，經處理的 表面顯示出成功的共價連接。通過原子力顯微鏡測量經涂布的表面上的刮擦，顯示出第一 層(第一點擊）的厚度為15nm。對于形成水凝膠層(第Ξ點擊），可W確定35nm的高度。而且， 通過使用紅外光譜可W顯示成功的連接。
【主權項】
1. 用于連接和釋放遺傳物質的新型聚乙烯亞胺-基共聚物，所述遺傳物質特別是DNA/ RNA，所述聚乙烯亞胺-基共聚物包括乙烯亞胺單元和2-噁唑啉單元，以通式I的化合物代 表： 其中，a、b:各單體單元的比例(a、b>0)， d:側鏈的長度(1-20)， X: 2-噁唑啉單元官能團（經由雙鍵或三鍵）， 共聚物鏈長為2-1000000個單元。2. 根據權利要求1所述的新型聚乙烯亞胺-基共聚物，其中所述共聚物具有根據通式II 的不同的噁唑啉單元：其中， a、b、c:各單體單元的比例(a、b、c>0)， d:側鏈的長度(1-20)， X: 2-噁唑啉單元官能團（經由雙鍵或三鍵）， R: Η或有機基團（例如，烷基和芳基基團）， 共聚物鏈長為2-1000000個單元。3. 制備用于連接和釋放遺傳物質的新型聚乙烯亞胺-基共聚物的方法，所述遺傳物質 特別是DNA/RNA，所述聚乙稀亞胺-基共聚物由乙稀亞胺單元和2-噁唑啉單元構成，其特征 在于通式III的合成：4. 根據權利要求3所述的方法，其中在-OH或-NHS作為酸的情況下，在活化劑的存在下 弓丨入官能化，所述活化劑特別是EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)或DCC(二環己基碳二亞胺）。5. 根據權利要求3所述的方法，其中通過采用不飽和酸酐 或鹵化物(_C1、-Br、-I)進行在后官能化來引入功能性側鏈。6. 根據權利要求1或2所述的新型聚乙烯亞胺-基共聚物的用途，所述聚乙烯亞胺-基共 聚物用于將基底表面官能化，從而連接和釋放遺傳物質，所述基底特別是珠粒和顆粒。7. 根據權利要求1或2所述的新型聚乙烯亞胺-基共聚物的用途，所述聚乙烯亞胺-基共 聚物用于制備結構化水凝膠層或用作結構化水凝膠層的組分，從而連接和釋放遺傳物質， 所述結構化水凝膠層特別是珠粒和顆粒。
【專利摘要】本發明涉及一種共聚物，所述共聚物是根據通式I的化合物，可以低成本并且耗時短地來制備所述共聚物，所述共聚物是根據需要特制的，并且對于對于廣泛有效的用途具有高官能性，而不限制它們對遺傳物質(特別是DNA/RNA)的粘合力。所述新型共聚物是通過通式III的合成來制備的。
【IPC分類】C08G73/02
【公開號】CN105683256
【申請號】
【發明人】C·恩勒特, L·陶哈爾特, M·戈特沙爾克, U·S·舒伯特
【申請人】耶拿市弗里德里希·席勒大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年10月2日