專利名稱：利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法的制作方法
(一)技術領域植物育種及生物技術領域。
背景技術：
在植物育種過程中，利用親緣關系較遠的種、屬間進行遠緣雜交，如李與杏的雜交，比種內品種間的常規有性雜交，可產生更加豐富的遺傳變異，不僅是種質創新的有效途徑之一，而且在物種的形成、演化及系統發育等生物學問題的研究上，具有重要的理論意義。但在植物長期的進化過程中，形成了各種隔離機制，遠緣雜交難度很大，遇到的第一個障礙就是遠緣雜交的不親和性，主要表現為①花粉在異種植物的柱頭上不能萌發；②或雖能萌發，但花粉管生長緩慢，或花粉管太短，不能進入子房到達胚囊；③或花粉管雖然進入子房，到達胚囊，但不能受精，或只有卵核或極核發生單受精，從而導致不能得到雜交種子。遇到的第二個障礙就是遠緣雜種的不育(孕)性，主要表現為①受精后的幼胚不發育，發育不正常或中途停止；②胚乳發育不正常，致使雜種胚部分或全部死亡；③種子不能發芽，或雖能發芽，但幼苗早期天亡；④雜種植株不能正常開花結實。因此，遠緣雜交的不親和性及雜種的不育性是導致植物遠緣雜交育種進展緩慢的主要原因，同時也是急待研究解決的重要問題。
果樹的遠緣雜交育種研究雖然已有幾十年的歷史，但多數研究報道主要是比較了桃、李、杏等核果類果樹遠緣雜交的親和性(坐果率)，如何進一步采取一些措施，利用現代高新技術克服遠緣雜交的不親和性及雜種的不育性方面的系統研究，報道甚少。因此，探討克服遠緣雜交不親和性和雜種不育性的有效方法，創造新品種、新種質，對豐富果樹種質資源的遺傳多樣性，選育優新品種等具有重大意義。
發明內容本發明提供克服核果類果樹遠緣雜交不親和性和遠緣雜種不育性的系統方法，即將物理手段、有性雜交、組織培養及分子生物學技術科學集成的三級放大法。
本發明通過如下技術措施實現①父本花粉用原光斑直徑7mm的氦氖激光處理8min或強度為434.78KVm-1的負高壓平板靜電場處理30min，以自交親和或自然坐果率高的種或品種作母本，在鈴鐺花期用處理后的花粉授粉，可有效地克服遠緣雜交的不親和性，提高遠緣雜種的坐果率(一級放大)；②在授粉后的3～5周，雜種胚大量敗育前對雜種幼胚進行胚搶救，即通過組織培養技術，以獲得更多的遠緣雜種胚培苗(二級放大)。用于李樹幼胚萌發及生長的培養基配方為MS+BA 2mgL-1+IAA 0.3mgL-1，櫻桃幼胚萌發及生長的培養基配方為1/2MS+BA 2mgL-1+IAA 1mgL-1+Vc 10mgL-1；③研究并建立雜種胚培苗多叢芽再生技術體系，擴大每個雜種胚培苗(基因型)的個體數量，保證每個雜種胚培苗能在田間定植后有一定的成活苗，防止因雜種胚培苗的中途死亡而導致的基因型丟失(三級放大)。用于李雜種胚培苗多叢芽誘導及增殖的培養基配方為MS+BA 1.5mgL-1+IAA0.3mgL-1，生根培養基配方為1/2MS+IAA 0.8mgL-1；櫻桃雜種胚培養多叢芽誘導及增殖的培養基配方為1/2MS+BA 2mgL-1+IAA 1mgL-1+NAA 0.1mgL-1+Vc 10mgL-1，生根培養基配方為1/2MS+IBA 0.2mgL-1+Vc 10mgL-1；④用隨機擴增的多態性DNA測定(RAPD)對雜種胚培苗進行早期鑒定，以確定其雜種遺傳性狀。
利用研制的上述方法，目前已將李×杏、杏×李及歐洲甜櫻桃×中國櫻桃等核果類果樹的一批遠緣雜種胚培苗定植于大田，其中歐洲甜櫻桃與中國櫻桃的遠緣雜種是國內外首次獲得。進一步豐富了核果類果樹種質資源的遺傳多樣性，為進一步選育優新品種奠定了基礎。同時也證明了所研制的三級放大法是十分有效的。
圖1利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質流程1中，1是父本花粉的采集及貯藏；2是采集到花粉分別用氦氖激光、負高壓平板靜電場處理，處理后的花粉放置在低溫干燥器內保存備用；3是用處理過的花粉進行人工授粉，并于授粉后2-5周調查雜種胚敗育情況；4是雜種果實的采集及幼胚接種培養；5是分別取已萌發并且生長良好的胚培苗轉接到多叢芽及增殖培養基中；6是分別將多叢芽梢轉接到生根培養基中進行生根培養；7是經7-10天的煉苗后，移栽到溫室花盆中，并進行RAPD早期鑒定；8是將雜種胚培苗定植到田間。
具體實施方式
實施例于春季果樹鈴鐺花期采集充分發育成熟的花藥(父本花期晚于母本的，要在溫室提前催花)，去除花絲、花瓣及萼片等雜質，置18-20℃的室內陰干，收集花粉于干燥器內的小瓶中，將干燥器置于1-3℃冰箱內(1)；花粉用原光斑直徑7mm的氦氖激光處理8min或強度為434.78KVm-1的負高壓平板靜電場處理30min后，繼續放置在1-3℃冰箱貯存備用(2)；選取樹勢健壯、生長結果正常的樹作為雜交母樹，采用連被去雄法去雄后(用“V”形去雄器或手指甲將花瓣、雄蕊及萼筒一次去掉)，用處理過的花粉進行人工授粉，掛牌標記，并于授粉后的2～5周及時調查雜種胚敗育發生的時間(3)；然后于授粉后的2～5周，分期采集雜種果實，經30天的低溫(1-4℃)處理，再經70％酒精滅菌1min，10％次氯酸鈉滅菌10min后取幼胚接種到胚萌發及生長培養基中(4)，其中李樹幼胚萌發及生長培養基配方為MS+BA 2mgL-1+IAA 0.3mgL-1，櫻桃幼胚萌發及生長培養基配方為1/2MS+BA 2mgL-1+IAA 1mgL-1+Vc 10mgL-1；經一定時期的培養后，取已萌發并且生長良好的胚培苗轉接到多叢芽誘導及增殖培養基中，其中李雜種胚培苗多叢芽誘導及增殖培養基配方為MS+BA 1.5mgL-1+IAA0.3mgL-1，櫻桃雜種胚培養多叢芽誘導及增殖培養基配方為1/2MS+BA 2mgL-1+IAA 1mgL-1+NAA 0.1mgL-1+Vc10mgL-1(5)；經多次繼代增殖培養后，將多叢芽梢轉接到生根培養基中進行生根培養，其中李樹生根培養基配方為1/2MS+IAA 0.8mgL-1，櫻桃生根培養基配方為1/2MS+IBA 0.2mgL-1+Vc 10mgL-1(6)；待主根長1-3cm，并有一定側根時，打開試管的封口棉塞，在室溫(20℃左右)、直射陽光下煉苗7-10天后，從試管內取出小苗，將培養基洗凈，移栽到上部為消毒沙、下部為營養土的花盆內，在溫室內進行培養。注意加強光照、通風，及時澆營養液。然后取葉片提取DNA，進行RAPD早期鑒定(7)；根據RAPD的鑒定結果，將確系遠緣雜種的胚培苗于早春(4月上旬)按2×3m(株行距)定植到大田選種圃(8)。
權利要求
1.一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于運用氦氖激光和負高壓平板靜電場處理李、杏、櫻桃樹等花粉，通過培養基專用配方培養幼胚苗、多叢芽胚培苗和生根胚培苗，并利用分子生物學技術對雜種胚培苗進行早期鑒定。
2.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于氦氖激光處理花粉的原光斑直徑為7mm，時間為8min；負高壓平板靜電場處理花粉的強度為434.78KVm-1，時間為30min。
3.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于選擇自交親和或自然坐果率高的種或品種作母本，在鈴鐺花期實施授粉。
4.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于幼胚苗培養基配方李樹為MS+BA2mgL-1+IAA0.3mgL-1；櫻桃樹為1/2MS+BA2mgL-1+IAA1mgL-1+VC10mgL-1。
5.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于多叢芽誘導及增殖胚培苗培養基配方李樹為MS+BA1.5mgL-1+IAA0.3mgL-1；櫻桃樹為1/2MS+BA2mgL-1+IAA1mgL-1+NAA0.1mgL-1+VC10mgL-1。
6.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于胚培苗生根培養基配方李樹為1/2MS+IAA0.8mgL-1；櫻桃樹為1/2MS+IBA0.2mgL-1+VC10mgL-1。
7.根據權利要求1所述的一種利用遠緣雜交創造核果類果樹新種質的三級放大法，其特征在于利用S等位基因專一PCR及RAPD技術對遠緣雜種胚培苗進行早期鑒定。
全文摘要
本發明提供克服核果類果樹遠緣雜交不親和性及遠緣雜種不育性的系統方法，即三級放大法父本花粉用強度為434KVm
文檔編號A01H1/02GK1541515SQ200310105489
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優先權日2003年11月7日
發明者陳學森, 張艷敏 申請人:山東農業大學