專利名稱：一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌及Bt殺蝗劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌，同時還涉及殺蝗劑的制備方法。該株抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌對直翅目的東亞飛蝗等有活性毒性，其活性物質為殺蟲晶體蛋白質。用該菌株制備的殺蝗劑可用于直翅目害蟲如蝗蟲等的防治，殺蟲晶體蛋白質基因可用于高效工程菌的構建和抗蟲轉基因植物的研究。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)由于具有殺蟲效果好，特異性強，生產和使用方便，不污染環境等特點而在害蟲生物防治中發揮了重要作用。不同的Bt菌株產生不同的殺蟲晶體蛋白質(Insecticidal Crystal Proteins，簡稱ICPs)，使得菌株間的殺蟲譜和殺蟲活性存在明顯差異。現已報道，蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等9個目的昆蟲和螨類、植物線蟲、原生動物、扁形動物等有特異性殺蟲活性。目前，篩選高效特異性Bt菌株，發掘新的ICP基因，對菌株進行遺傳改良或構建高效廣譜基因工程菌是世界性的課題，也是Bt研究的發展趨勢，據報道，全世界已分離出了71個H血清型86個亞種的數萬株蘇云金芽孢桿菌，從分離的菌株中篩選出了多株對鱗翅目和鞘翅目等害蟲有毒效的菌株。在蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定、篩選方面，文獻“土壤來源的蘇云金芽孢桿菌的形態、δ-內毒素蛋白質及其毒力特性(微生物學報，1992，32(6)387-393)”、“從土壤分離的410株蘇云金芽孢桿菌的鑒定(華中農業大學學報，1994，第二期)、“我國南北方土壤中蘇云金芽孢桿菌的分布及殺蟲特性”(微生物學報，1996，36(4)；295-302)、及“土壤來源的五個蘇云金芽孢桿菌新亞種的鑒定(微生物學報，1999，39(2)154-159)等對我國蘇云金芽孢桿菌的分離、鑒定、分布特點、晶體蛋白質形態、殺蟲特性等進行了研究。在高效、特異性菌株的篩選方面，文獻“對斜紋夜蛾高毒力的Bt新分離株及其特性的研究(微生物學通報，1997，24(5)262-265)”、“對夜蛾幼蟲高毒力的蘇云金芽孢桿菌菌株及其晶體蛋白質特征(中國生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“蘇云金芽孢桿菌對甜菜夜蛾毒性的篩選(中國病毒學，2000，Vol.1598-101)、“一株廣譜蘇云金芽孢桿菌及其發酵條件的研究”(華中農業大學學報，2003，22(5)462-465)”等分別從眾多的蘇云金芽孢桿菌菌株中篩選到了殺鱗翅目夜蛾科害蟲的高效特異性菌株；文獻“蘇云金芽孢桿菌抗東亞飛蝗(Locust migratoria manilensis)的活性”(應用與環境生物學報，2005，11(5)592-594)報道了蘇云金芽孢桿菌抗蝗蟲的活性。在殺蟲基因克隆方面，自1981年第一個殺蟲晶體蛋白質基因被克隆以來，目前全世界內已克隆了50類300多個蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白質Cry基因和兩類Cyt基因(http//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt)。文獻“抗鞘翅目δ-內毒素及毒素基因文庫的構建(生物工程學報，1994，10(2)103-108)”、“蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質基因的啟動子及其轉錄調控(微生物學通報，1999，26(2)130-134)”、“蘇云金芽孢桿菌高效菌株cry基因分析及多價基因組合的研究(南開大學學報，1999，32(3)163-168)”等分別建立了抗鞘翅目δ-內毒素的基因文庫、克隆了殺鱗翅目害蟲的基因，對蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質基因的表達與調控進行了闡述。文獻“廣譜重組Bt菌的構建及基因的高效表達”(《微生物農藥及其產業化》，喻子牛主編，科學出版社，2000，55-61)用電擊轉化方法將殺鱗翅目害蟲的晶體蛋白質基因crylAc轉入殺鞘翅目害蟲的Bt菌株中，獲得了廣譜殺鱗翅目和鞘翅目害蟲的Bt工程菌；“殺蟲防病基因工程枯草芽孢桿菌的構建”(生物工程學報，-1999，15(2)215-220)以枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質粒載體pHB201和pRP22為載體，通過感受態轉化方法，將蘇云金芽孢桿菌HD-1殺蟲蛋白質基因crylAc導入水稻紋枯病生防菌株枯草芽孢桿菌B916。工程菌株質粒酶切電泳分析，核酸印記(Southern)分析和殺蟲生物活性測定結果證實了crylAc基因的導入及其在B916中的有效表達。抑菌測定證明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。在殺蟲劑的研制方面，文獻“殺鞘翅目蘇云金芽孢桿菌新菌株及其殺蟲劑的研究”(微生物學報，1999.12，Vol.39(6)515-520)及“廣譜重組蘇云金芽孢桿菌的生產工藝研究”(中國病毒學，2000.Vol.15192-195)等分別對不同殺蟲特點的蘇云金芽孢桿菌的發酵和后處理工藝進行的研究。
蝗蟲(Locust)是世界性的重大農業害蟲。蝗災與水災、旱災常相間或伴隨發生而成為人類歷史上農業三大自然災害。自80年代起，全球的蝗蟲災害進入頻發階段，除南極外，各大洲均有蝗災發生，常年發生面積達4680萬平方公里，有八分之一的人口常年受到蝗災的襲擾。我國的蝗災也隨之加重，從1997年起，我國連續幾年大面積爆發蝗災，最高蟲口密度可達到3000-10000頭/m2。蝗蟲中的東亞飛蝗(Locust migratoria manilensis)主要分布在東亞、東南亞地區，如中、日、菲、泰、越等國，在我國分布范圍最廣、成災最頻繁、最嚴重。蝗災在我國頻繁發生主要有三方面原因一是，我國氣候旱澇交替，先澇后旱往往是蝗災發生的前兆；其次，我國現有蝗區80％都是雜草叢生的河灘、近海鹽堿地及水面漲落不定的濱湖和水庫區等，改造這些蝗蟲的孳生地相當困難；另外，治蝗措施單一，主要采用有機磷、菊酯類等廣譜性化學農藥，使蝗蟲天敵也被殺傷，蝗蟲因免受自然天敵的控制而更趨猖獗。蝗災的頻發，不僅給農業生產造成了重大損失，而且為了治理蝗災，要花費大量的人力、物力和財力。目前，對于蝗蟲的防治，仍然主要是采用飛機大面積噴灑化學農藥或人工使用噴霧器噴灑化學農藥，但是，這種大面積使用化學農藥的防治方式在迅速有效地遏制蝗害的同時，也殺死了大量蝗蟲的天敵，破壞了生態平衡，還使蝗蟲產生抗藥性，導致蝗災的惡性循環，而且也嚴重污染了生態環境，給人類健康造成威脅。因此在化學防治的同時，加大生物方法治蝗力度，建立與生態友好、資源可持續利用的蝗蟲治理體系和技術規范，已成為我國蝗蟲防治工作的當務之急。
近50年來，采用微生物防治蝗蟲發展較快。早在20世紀60年代末，美國開始研究和應用微生物----蝗蟲微孢子蟲防治蝗蟲，到20世紀80年代初期，該項生物防治技術被列入美國防治蝗蟲的計劃，蝗蟲微孢子蟲是世界上第一個注冊的防治蝗蟲的生物制劑，也是世界廣泛應用的治蝗生物制劑。美國注冊了白僵菌用于防治蝗蟲的制劑，英國和澳大利亞分別注冊綠僵菌制劑，并在很多國家進行田間試驗。除此之外，印度、美國成功地開發出了植物源殺蟲劑-印楝素。中國是較早開展生物治蝗的國家，在明清時期就有采用養雞、養鴨防治蝗蟲的實例，而且至今仍在一些地方應用。有關蝗蟲天敵的記錄，可以追溯到東晉時期，距今有1700多年。然而，直到20世紀80年中期，我國才真正開展蝗蟲生物防治的研究和應用。中國農業大學首先從美國引入了蝗蟲微孢子蟲，經過近10年的努力，在深入研究了微孢子蟲致病機理、疾病傳播途徑和流行規律的基礎上，成功地研制出了人工大量繁殖蝗蟲微孢子蟲的技術、防治草原蝗蟲和東亞飛蝗的田間應用技術及其配套技術體系，累計示范應用1000多萬畝次，取得了良好的經濟效益、社會效益和生態效益，該項技術在國際上處于領先水平。中國農業科學院、重慶大學等單位開發研究了綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)制劑，經過多年室內實驗后，近年來也較為廣泛地開展了田間試驗示范。這些微生物制劑，均可以采用噴霧或噴粉的方法施用。同時，國內也有幾個廠家在生產印楝素、苦參堿等生物制劑。
然而到目前為止，有關高效抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌(Bt)特異性菌株及其殺蟲晶體蛋白質基因和Bt殺蝗劑還未見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌，該菌株對直翅目的蝗蟲等有特異性的毒殺作用，但對人、畜和環境安全。
本發明的另一個目的是提供了一種制備Bt殺蝗劑的方法，用該方法制備的殺蝗劑可用于危害水稻、小麥、玉米、高粱和牧草等蝗蟲的防治，其特點是特異性強，不殺傷昆蟲天敵，對人、畜無毒，對環境安全。
為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施發明的目的在于，分離篩選對直翅目的蝗蟲等害蟲具有特異性毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌。因此，篩選抗蝗蟲的Bt特異性菌株，可為研制Bt殺蝗劑奠定基礎。這對于更好地保持生物的多樣性，維護生態平衡，實現農業的可持續發展具有十分重要的意義。
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為NOM206061。BTH-13是一株從我國土壤樣品中分離、并以直翅目的東亞飛蝗為試蟲，經過毒力生物測定所篩選出的對直翅目的東亞飛蝗等害蟲有高毒力的菌株；該菌株的殺蟲活性是由其產生的124kD的殺蟲晶體蛋白質所決定的。
基本的技術原理是利用芽孢可耐80℃高溫的特性，在80℃高溫下通過彈土法分離蘇云金芽孢桿菌。以1齡東亞飛蝗為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量Lc50，篩選到該高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。
抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌菌株BTH-13的制備方法利用芽孢可耐80℃高溫的特性，在80℃高溫下通過彈土法，用普通固體細菌培養基倒平板，在30℃下培養3天，分離細菌單菌落。該普通固體細菌培養基的組成為蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.5％，用水補充體積至100ml。隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復紅染色后在光學顯微鏡下觀察，篩選能產生芽孢和晶體的蘇云金芽孢桿菌。根據分離該Bt菌株的土壤樣品來源地的名稱(Heilongjiang)的第一個字母組成其代碼BTH，又因該菌株是從同一批土壤樣品中分離的多株蘇云金芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為13的一株，因此將該蘇云金芽孢桿菌命名為BTH-13。
以東亞飛蝗為試蟲，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量Lc50，篩選到該高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。
該菌株的具體特征如下抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13的基本特征a.形態學特征Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13的細胞形態為桿狀，產生橢圓行芽孢和菱形伴孢晶體蛋白質。
b.培養特征Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13牛肉膏-蛋白胨瓊脂平板培養基中30℃培養24小時，形成針尖大小的淺黃色小菌落，邊緣平滑，培養72小時，形成園盤狀菌落，乳白色，邊緣不整齊，表面似毛玻璃，有皺紋。
c.生理生化特性蘇云金芽孢桿菌BTH-13菌株的主要生理生化特征
d.血清型以BTH-13的鞭毛抗原與Bt的標準抗血清進行凝集反應及交叉吸收凝集反應試驗，BTH-13的H血清型為H16，但含有不同于Bt.subsp.indiana亞種的鞭毛抗原成分，因此該菌株可能是Bt中的一個新亞種，暫定名為Bacillusthuringiensis ssp.BTH-13(Bt.subsp.locustcidus)。
e.殺蟲晶體蛋白質經SDS-PAGE分析，菌株BTH-13產生128kD的殺蟲晶體蛋白質。
h.殺蟲特性經毒力生物測定，菌株BTH-13對東亞飛蝗等直翅目害蟲有較高殺蟲活性，其發酵液和晶體蛋白質經過堿和蛋白酶處理后，可明顯提高抗蝗蟲的活性。
i.發酵性能菌株BTH-13易于培養，發酵性能優良，在合適的發酵條件下生長整齊，發酵周期短。
抗蝗蟲Bt殺蟲劑的制備抗蝗蟲Bt菌株BTH-13殺蟲劑(殺蝗劑)的制備搖瓶發酵搖瓶發酵的目的在于選擇最佳發酵配方，優化發酵條件，采用不同的含固量和不同的C/N比進行L9(34)正交試驗。
表2 L9(34)正交實驗因子/水平百分含量表
根據正交試驗，獲得菌株BTH-13的最佳培養基配方為在100單位體積的培養基中，淀粉3.0-4.0％、豆餅粉1.8-2.4％、棉餅子粉1.2-1.8％、蛋白胨0.5-0.9％、酵母粉0.4％、玉米漿2.0％、7水硫酸鎂(MgSO47H2O)0.04％、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2％、磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.2％、碳酸鈣(CaCO3)0.1％、及α-淀粉酶(淀粉含量的1/400)，用水補充至體積100。
利用上述培養基配方，在500ml的三角瓶中裝100ml培養基，滅菌后接種BTH-13，在30℃搖床中以200轉/分鐘培養至80％的芽孢脫落。搖瓶發酵液進行毒力生物測定。
在全自動發酵罐中的小試采用篩選出來的最佳發酵配方，在全自動發酵罐中進行發酵試驗，培養基消前pH7.8，消后pH為7.0左右。每罐接種一支經60℃處理30分鐘的斜面菌種，接種溫度37℃。采用變溫、變速、變壓(0-11小時，32℃、500轉/分、通氣量0.6立方米/小時；12-21小時，29℃2、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時；22-發酵結束，32℃、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時)的發酵手段，確定了一套最佳發酵工藝。發酵周期為38小時，發酵結束后發酵液酸化至pH5.0，加入0.1％乳化劑(農乳100)，制成乳懸劑。發酵液濃縮后直接噴霧干燥或加10％填充料(碳酸鈣)后噴霧干燥制備可濕性粉劑。
Bt殺蝗劑的中試和生產根據小試發酵的條件在10噸的發酵罐中進行中試，中試產品進行毒力生物測定。在中試基礎上進行大規模的生產。
優點和效果蘇云金芽孢桿菌BTH-13具有殺東亞飛蝗等直翅目害蟲的特點，國內目前尚無殺東亞飛蝗等直翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌商品制劑，因而可利用BTH-13生產新型蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蝗劑，使蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的產品多樣化和系列化，擴大蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的使用范圍，降低農藥防治費用、減少化學農藥對環境的污染，增加農作物產量。BTH-13的殺蟲晶體蛋白質基因可用于Bt菌株的遺傳改良以構建高效抗蝗蟲的Bt工程菌，并可用于轉基因植物的研究以獲得抗蝗蟲的牧草和農作物。因而，從優越而獨特的殺蟲特性、生產和使用成本低、工業化生產技術成熟、對人和動植物安全、不污染環境及市場需求等方面考慮，蘇云金芽孢桿菌BTH-13及其殺蟲基因具有良好的推廣應用前景。
Bt菌株BTH-13抗東亞飛蝗的毒力
具體實施方式
1.抗蝗蟲蘇云金芽孢桿菌菌株BTH-13的制備方法利用芽孢可耐80℃高溫的特性，在80℃高溫下通過彈土法，用普通固體細菌培養基倒平板，在30℃下培養3天，分離細菌單菌落。該普通固體細菌培養基的組成為蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.5％，用水補充體積至100ml。隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復紅染色后在光學顯微鏡下觀察，篩選能產生芽孢和晶體的蘇云金芽孢桿菌。根據分離該Bt菌株的土壤樣品來源地的名稱(Heilongjiang)的第一個字母組成其代碼BTH，又因該菌株是從同一批土壤樣品中分離的多株蘇云金芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為13的一株，因此將該蘇云金芽孢桿菌命名為BTH-13。
以東亞飛蝗為試蟲，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量Lc50，篩選到該高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。
2.抗蝗蟲Bt殺蟲劑的制備抗蝗蟲Bt菌株BTH-13殺蟲劑(殺蝗劑)的制備搖瓶發酵搖瓶發酵的目的在于選擇最佳發酵配方，優化發酵條件，采用不同的含固量和不同的C/N比進行L9(34)正交試驗。
表2 L9(34)正交實驗因子/水平百分含量表
根據正交試驗，獲得菌株BTH-13的最佳培養基配方為在100單位體積的培養基中，淀粉4.0％、豆餅粉2.4％、棉餅子粉1.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.4％、玉米漿2.0％、七水硫酸鎂(MgSO47H2O)0.04％、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2％、磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.2％、碳酸鈣(CaCO3)0.1％、及α-淀粉酶(淀粉含量的1/400)，用水補充至體積100。
利用上述培養基配方，在500ml的三角瓶中裝100ml培養基，滅菌后接種BTH-13，在30℃搖床中以200轉/分鐘培養至80％的芽孢脫落。搖瓶發酵液進行毒力生物測定。
在全自動發酵罐中的小試采用篩選出來的最佳發酵配方，在全自動發酵罐中進行發酵試驗，培養基消前pH7.8，消后pH為7.0左右。每罐接種一支經60℃處理30分鐘的斜面菌種，接種溫度37℃。采用變溫、變速、變壓(0-11小時，32℃、500轉/分、通氣量0.6立方米/小時；12-21小時，29℃、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時；22-發酵結束，32℃、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時)的發酵手段，確定了一套最佳發酵工藝。發酵周期為38小時，發酵結束后發酵液酸化至pH5.0。加入0.1％乳化劑(農乳100)，制成乳懸劑。發酵液濃縮后直接噴霧干燥或加10％填充料(碳酸鈣)后噴霧干燥制備可濕性粉劑。
Bt殺蝗劑的中試和生產根據小試發酵的條件在10噸的發酵罐中進行中試，中試產品進行毒力生物測定。在中試基礎上進行大規模的生產。
發酵液的酶解在BTH-13發酵液中加入10M氫氧化鉀(NaOH)，調發酵液的pH值到11.0左右。37℃溫育3h，鏡檢觀察，直到晶體完全溶解。加入胰蛋白酶，使其終濃度為25mg/ml，37℃溫育2-4h。
晶體蛋白的酶解5mg/ml晶體原毒素蛋白質溶于0.05M碳酸鈉-碳酸氫鈉(Na2CO3-NaHCO3)(pH10)的緩沖液中37℃溫育3h，鏡檢觀察，直到晶體完全溶解。加入胰蛋白酶干粉，使其中濃度為25mg/ml，37℃溫育過夜，5000rpm離心5min，棄去沉淀，留上清液，加苯甲基磺酰氟(PMSF)終止酶反應，做進一步提純和電泳分析用。
權利要求
1.一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌，其特征在于，蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis BTH-13，CCTCC NOM206061。
2.一種蘇云金芽孢桿菌BTH-13殺蟲劑的制備方法，其特征在于，它包括下列步驟A、搖瓶發酵獲得菌株BTH-13的培養基配方為，在100單位體積的培養基中，淀粉3.0-4.0％、豆餅粉1.8-2.4％、棉餅子粉1.2-1.8％、蛋白胨0.5-0.9％、酵母粉0.4％、玉米漿2.0％、七水硫酸鎂0.04％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、碳酸鈣0.1％、及α-淀粉酶/淀粉含量的1/400，用水補充至體積100；B、利用A步驟的培養基配方，在500ml的三角瓶中裝100ml培養基，滅菌后接種BTH-13，在30℃搖床中以200轉/分鐘培養至80％的芽孢脫落；C、采用A步驟中篩選出來的培養基，在全自動發酵罐中進行發酵試驗，培養基消前pH7.8，消后pH為7.0，接種一支經60℃處理30分鐘的斜面菌種，接種溫度37℃，用變溫、變速、變壓/11小時，32℃、500轉/分、通氣量0.6立方米/小時；12-21小時，29℃、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時；22-發酵結束，32℃、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時的發酵，發酵周期為38小時，發酵結束后發酵液酸化至pH5.0，加入0.1％乳化劑，制成乳懸劑，酵液濃縮后直接噴霧干燥或加10％碳酸鈣后噴霧干燥制備可濕性粉劑。
全文摘要
本發明公開了一種抗蝗蟲的蘇云金芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis BTH－13，CCTCC NOM206061。制備殺蟲劑的步驟是首先是搖瓶發酵，在100單位體積的培養基中，按比例加入淀粉、豆餅粉、棉餅子粉、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、及α－淀粉酶，補充水；其次是在三角瓶中裝100ml培養基，滅菌后接種BTH－13，在一定溫度培養至芽孢脫落；第三是采用篩選出來的培養基，在全自動發酵罐中進行發酵，發酵結束后發酵液酸化，加入乳化劑，酵液濃縮后直接噴霧干燥制備可濕性粉劑。本發明的特點是特異性強，不殺傷昆蟲天敵，對人畜無毒，不污染環境，增加農作物產量，具有良好的應用前景。
文檔編號A01P17/00GK1876807SQ20061001956
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月7日 優先權日2006年7月7日
發明者高梅影, 戴順英, 宋玲莉 申請人:中國科學院武漢病毒研究所