蘇云金芽胞桿菌fh21、殺蟲基因,表達蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物防治技術領域，特別是進一步，本發明涉及對鱗翅目農業害蟲具 有高毒力的Bt殺蟲基因及由該基因所編碼的蛋白質。
【背景技術】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌炬acillus thuringiensis,簡稱化）是一種分布廣泛的革蘭 氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人 無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種 害蟲有活性。化在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白（Insecticidal化ystalProteins， ICPs)，也稱5-內毒素（delta-endotoxin),它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切 關系[Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D.民.，Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol.Biol. Rev, 1998,62(3) : 775-806.]。自 1981 年 Schnepf 等克隆了 Bt 的第 一個ICPs基因，并于1985年發表了它的DM堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前 (2014年4月）共776個，其中C巧基因738個，C巧模式基因289個；基因38個，模 式基因11個。當今，采用噴施化學農藥防治手段固然可W減輕害蟲對農作物的為害，但化 學農藥造成環境污染，長期W來，大量噴施化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益 蟲及其它生態區系遭受破壞，而且嚴重污染環境，提高生產成本，破壞生態平衡。蘇云金 芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用于蟲害防治。蘇 云金芽胞桿菌除了直接作為生物農藥W外，1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲 準應用，它使用的基因來自化C巧lAc。在接下來的幾年里，轉crylAb基因的抗蟲玉米，轉 C巧3Aa基因的抗蟲±豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/c巧lAb 基因的抗蟲棉W來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年（1996-2007)中， 由于能得到持續穩定的收益，農民種植轉基因作物量逐年增加。2013年，27個國家的1800 萬農民種植了 1.752億公頃（4. 33億英畝）的轉基因作物，比2012年持續增長了 3%，即 500萬公頃（1200萬英畝）。1800萬農民從轉基因作物中獲益，其中90%為資源匿乏的小農 戶。前五個種植轉基因作物的發展中國家是亞洲的中國和印度、拉下美洲的己西和阿根廷 W及非洲的南非，共種植8270萬公頃的轉基因作物，占全球轉基因作物種植面積的47%， 并且該五個國家的人口約占全球70億人口的41%。中國750萬資源匿乏的小農戶種植了 420萬公頃的化棉花，采用率為90%，平均每戶農民種植0.5公頃的化棉花。轉基因作 物商業化給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。蘇云金芽胞桿菌及 其基因發掘已成為可持續發展農業中重要課題。
[0003] 由于目前商品化的轉基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來避免害蟲抗藥性上升的風險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的化殺蟲基因，可 W豐富殺蟲基因資源，為轉基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高化轉基因產品的 抗蟲效果，并且可w降低害蟲對化毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要 的經濟、社會和生態效益。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種對鱗翅目害蟲高毒力的蘇云金芽胞桿菌菌株FH21，及其殺蟲新基 因crylBb，C巧IDa，C巧lid, cryUa和其晶體殺蟲蛋白，W應用于轉化微生物和植物，使之 表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。
[0005] 蘇云金芽胞桿菌菌株F肥1，其保藏編號為；CGMCC No. 10090。
[0006] 蘇云金芽胞桿菌菌株F肥1在殺滅鱗翅目農業害蟲中的應用。
[0007] 殺蟲蛋白化yl化3,化yl化4,化ylld3或化yUa3,其氨基酸序列如SEQ ID NO 2、 沈Q ID NO 4、沈Q ID N06、沈Q ID NO 8 所示。
[0008] 基因 crylI3b3，crylDa4, c;rylld3 或 crylja3,編碼殺蟲蛋白 CrylI3b3，CrylDa4， Crylld3, Crylja3。
[0009] 所述基因序列如 SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7 所示。
[0010] 一種表達載體，其特征是含有crylI3b3, crylDa4, crylld3或crylja3基因。
[0011] 所述表達載體為祀日-。巧1化3,祀B-crylDa4, p邸-cirlld3或祀B-cryUa3,其骨 架載體為祀B，其結構如圖6所示。
[0012] 一種微生物轉化體，其特征是含有(：巧1化3, crylDa4, crylld3或crylja3基因。
[0013] 基因cryl化3, C巧lDa4, C巧lld3, C巧lja3在殺滅鱗翅目農業害蟲中的應用。
[0014] 所述應用是將cryl化3, crylDa4, crylld3或crylja3基因表達的蛋白作為生物殺 蟲劑的有效成分。
[0015] 本發明人從黑龍江省鳳凰山附近±壤中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株F肥1， 其保藏編號為CGMCC No. 10090,該菌株生物學特性為在生長周期中可W產生芽胞，并且同 時產生有毒殺銷翅目害蟲作用的伴胞晶體，其對鱗翅目農業害蟲具有很強的殺滅能力；從 該菌株中得到4個基因的陽性克隆，即祀B-cryim^，P邸-cirlDa，祀B-crylld，P邸-cirlja (見圖6)，對其進行測序分析，在NCBI網站上應用BLAST并應用DNAMAN等生物軟件進行分 析，分析結果證明所克隆的基因是cryl化基因，該基因編碼框是由3609個堿基組成，編碼 氨基酸數量為1203個，經過比對發現該基因所編碼的蛋白與化ylBb2的氨基酸同源性是最 高的，它們的一致性達到了 99%，所W該基因應屬于第四等級的新基因，提交GenBank獲得 登錄號為KJ619659,經國際5-內毒素命名委員會正式命名為化yl化3。該蛋白比對結果 如下：
[001引 〉0巧1化：
[0017] Length = 1203
[0018] Score = 2500bits 巧480), Expect = 0. 0
[0019] Identities = 1202/1203 巧9 % ),化sitives = 1202/1203 巧9 % ), Gaps = 0/1203(0% )
[0020] 在NCBI網站上應用BLAST并應用DNAMAN等生物軟件進行分析uw，分析結果 證明所克隆的基因是cryWa基因，該基因編碼框是由3492個堿基組成，編碼氨基酸數量 為1164個，經過比對發現該基因所編碼的蛋白與&yH)a2的氨基酸同源性是最高的，它們 的一致性達到了 99%，所W該基因應屬于第四等級的新基因，提交GenBank獲得登錄號為 KJ619660,經國際5-內毒素命名委員會正式命名為化yl化4。該蛋白比對結果如下：
[0021] 〉CrylDa:
[0022] Length = 1164
[0023] Score = 2409bits 巧242), Expect = 0. 0
[0024] Identities = 1160/1164 巧9 % ),化sitives = 1162/1164 巧9 % ), Gaps = 0/1164(0% )
[00巧]在NCBI網站上應用BLAST并應用DNAMAN等生物軟件進行分析uw，分析結果 證明所克隆的基因是crylld基因，該基因編碼框是由2160個堿基組成，編碼氨基酸數量 為720個，經過比對發現該基因所編碼的蛋白與化ylldl的氨基酸同源性是最高的，它們 的一致性達到了 99%，所W該基因應屬于第四等級的新基因，提交GenBank獲得登錄號為 KJ619661，經國際5-內毒素命名委員會正式命名為化ylld3。該蛋白比對結果如下：
[0026] 〉CrylId:
[0027] Length = 720
[0028] Score = 1489bits (3856), Expect = 0.0
[0029] Identities = 715/719巧9 % ),Positives = 719/719(100 % ), Gaps = 0/719(0% )
[0030] 測序結果經DNAMAN軟件分析處理于NCBI-BLASTP比對，比對結果顯示化F肥1中 的cryl類基因編碼的殺蟲蛋白與cryUa的氨基酸同源性最高，一致性為99%。與化yUal 同源性最高僅有5個氨基酸位點存在差異（見表3-7)。基因登錄號JQ228425,化命名委 員會將其命名為cryUa3,比對結果如下：
[0031] 〉CryUa
[0032] Length = 789
[0033] Score = 2410bits 巧246), Expect = 0. 0
[0034] Identities = 1161/1166巧9 % ),化sitives = 1162/1166巧9 % ),, Gaps = 0/1166(0% )