專利名稱：一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種融合蛋白的制備方法，具體涉及一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的制備方法。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陽性菌，在其芽孢的形成過程中，會形成具有殺蟲活性的晶體蛋白(Cry蛋白)。該蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種害蟲具有較高的毒性，是應用最為廣泛的毒蛋白。由于此特性，編碼Cry蛋白的基因被生物學者認作是轉基因作物的熱門備選基因，并已有多個轉基因作物品種轉入該基因并商品化，在全球范圍內廣泛種植。Bt菌系含有大量不同的殺蟲晶體蛋白編碼基因，至今已有近180個不同的Bt殺蟲晶體蛋白基因被克隆和測序，cry34B就是其中一種。轉基因作物的種植滿足了人類對糧食產量、經濟效益需求。同時，也存在著環境安全風險，外源基因導入的隨機性和不確定性，基因表達對作物的生理生化作用的改變，對生態環境構成的威脅等等都難以預測。人們對轉基因作物的安全性存在擔憂，而消除這一擔憂的有效途徑就是對轉基因作物所表達的外源蛋白進行安全性評價。因此，獲取各種Bt殺蟲晶體蛋白基因所表達的外源蛋白，對進行安全性評價意義重大，為后續的檢驗方法建立、檢測標準的實施提供基礎，從而可以有效防止安全隱患的發生，避免轉基因作物對生態環境的破壞，充分發揮轉基因技術在農業生產上的巨大應用潛力
發明內容
本發明的一個目的是提供一種蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的編碼基因。本發明所提供的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的編碼基因，具有序列表中SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸序列。本發明的另一個目的是提供一種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的編碼基因，具有序列表中SEQ ID No:1中第5071-5601位核苷酸序列。含有上述蘇z 金芽抱桿菌晶體蛋白Bt Cry34B和晶體融合蛋白的編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組載體優選為重組表達載體或重組克隆載體。本發明的另一個目的是提供一種Bt Cry34B融合蛋白的制備方法。本發明所提供的Bt Cry34B融合蛋白的制備方法，包括以下步驟:I)將SEQ ID Ns.1中第5173-5580位核苷酸所示的DNA插入pET28a表達載體中，得到重組表達載體；2)將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌；3)培養所述重組菌，并進行誘導表達，收集菌體；裂解菌體，即得。Bt Cry34B融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Ns:2所示，共有176個氨基酸殘基，包括蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的氨基酸序列和組氨酸標簽序列。上述方法中，所述步驟3)包括以下步驟:a)將所述重組菌接種于含有50ug/mL Kan的LB培養基，37°C振蕩培養16h，得到培養物；b)將所述培養物按1%的體積接入含50ug/mL Kan的LB培養基，37°C振蕩培養3小時，得到培養液c)向所述培養液中加入IPTG至終濃度為lmM，30°C震搖培養6小時；d)將步驟c)所得產物4°C，IOOOOg離心lOmin，收集菌體。氨基酸序列如SEQ ID Na.2所示的蛋白也屬于本發明的保護范圍。本發明的表達載體含有T71ac啟動子，受乳糖操縱子調控，它的調控快速而靈敏。本發明方法克服了蘇云金桿菌晶體蛋白表達提取煩瑣、成本高的缺陷，具有簡便、快捷和高效的特點。本發明應用基因工程方法在國內首次合成Bt Cry34B基因，并首次制備出了 BtCry34B融合蛋白，為進一步探討該蛋白的檢測方法、生理功能及其作用機制、降解機制打下了基礎。
圖1 為 Bt Cry34B 融合蛋白 SDS-PAGE 圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。實施例1、Bt Cry34B融合蛋白的制備方法(一)Bt Cry34B基因編碼序列的優化和基因片段的獲得將Bt Cry34B基因序列(GenBank:AY536900.1)進行密碼子優化,優化后序列如SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸所示。(二)Bt Cry34B基因克隆載體的構建人工合成SEQ ID No:1中第5173-5580位核苷酸所示的核苷酸序列，即在目的基因兩端連上了酶切位點EcoR I和Xho I序列。將上述合成的核苷酸序列連接到pG0V4 (購自基因合成公司Gene Oracle Inc.)克隆載體質粒中，得到Bt Cry34B基因重組質粒,記作pG0V4_34B。對質粒進行測序驗證,結果表明質粒中插入的外源基因的序列如SEQ ID Na:1中第5173-5580位核苷酸所示。(三)BtCry34B基因重組表達載體及重組菌的構建將上述構建的克隆質粒pG0V4-34B用EcoR I和Xho I進行酶切，回收目的基因片段。將上述目的基因片段插入pET28a載體的EcoR I和Xho I酶切位點間，得到重組表達載體。 將重組表達載體轉化BL21 (DE3)感受態細菌，得到重組菌，記作BL21(DE3) -pET28a-34B。在含有50ug/mL Kan的LB培養基上選擇培養16h。從LB平板培養基上挑選單個菌落，經測序鑒定，鑒別出正向插入SEQ ID Ns:1中第5173-5580位核苷酸所示Bt Cry34B基因的重組表達載體，命名為pET28a-34B。上述重組表達載體pET28a_34B的全序列如序列表中SEQ ID Ns:1所示，其中，SEQID Na:1中第5071-5601位核苷酸為編碼框，編碼本發明所述的Bt Cry34B融合蛋白，BtCry34B融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ns:2所示，共有176個氨基酸殘基，包括蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的氨基酸序列和組氨酸標簽序列。(四)利用重組菌制備BtCry34B融合蛋白挑取鑒定陽性的重組菌BL21 (DE3) _pET28a_34B進行表達。a)將重組菌 BL21 (DE3)-pET28a_34B 接種于含有 50ug/mL Kan 的 LB 培養基，37°C振蕩培養16h，得到培養物；b)將所述培養 物按1%的體積接入含50ug/mL Kan的LB培養基，37°C振蕩培養3小時，得到培養液；c)向所述培養液中加入IPTG至終濃度為ImM，30°C震搖培養6小時；d)將步驟c)所得產物4°C，IOOOOg離心lOmin，收集菌體。e)室溫下用吸打或溫和潤旋使BugBuster Master Mix與菌體混勻，Img菌體:5ml BugBuster Master Mix。室溫下，50-100rpm 振蕩培養 20min,得到裂解液。BugBusterMaster Mix購自MERCK公司，產品目錄號為71456-3。f)將上述裂解液以4°C，16000g離心20min，收集沉淀(包涵體)，再向沉淀中加入BugBuster Master Mix稀釋液(用去離子水稀釋BugBuster Master Mix,使它的濃度是步驟e中BugBuster Master Mix濃度的1/10，所用體積為步驟e中所加體積的6倍),充分潤旋后4°C、5000g離心IOmin后傾去上清，重復3次后4°C、12000g離心15min，傾去上清得到高純度包涵體；向包涵體中加入包涵體溶解液(0.05M CAPS緩沖液，含0.3% (0.3g/100mL)N-十二燒基肌胺酸鈉；10mg包涵體對應ImL包涵體溶解液)，輕搖緩重懸包涵體；4°C、12000g離心20min后吸取上清，得到包涵體溶解液；g)將包涵體溶解液中的Bt Cry34B融合蛋白使用BugBuster N1-NTA His Bind和BugBuster His^Bind純化試劑盒進行進一步的純化(純化試劑盒購自Novagen公司，產品目錄號分別為70751-3和70899-3)。對照組:以轉入pET28a空載體的大腸桿菌BL21 (DE3)作為對照。將pET28a空載體轉化BL21 (DE3)感受態細菌，得到重組菌，記作BL21(DE3)-pET28a。在含有50ug/mL Kan的LB培養基上選擇培養16h。從LB平板培養基上挑選單個菌落，然后進行重組菌的培養和表達，最后對粗提的混合蛋白上清液進行電泳鑒定。電泳結果見附圖1中“空載體”電泳條帶。條帶顯示，對照組中沒有Bt Cry34B融合蛋白。(五)BtCry34B融合純化效果將步驟(四)得到的純化樣品，采用SDS-PAGE進行Bt Cry34B蛋白純化結果的驗證。Bt Cry34B融合蛋白的SDS-PAGE方法參照張龍翔等所著《生化實驗方法和技術》第二版，高等教育出版社(2006)，第100-106頁。采用5%濃縮膠，電壓50V。分離膠采用10%膠濃度，電壓120V。上樣量為30ul (樣品:上樣緩沖液為1:1)。SDS-PAGE結果如圖1所示。該圖表明得到目的蛋白。(六)BtCry34B融合蛋白產量檢測檢測方法:采用BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit,購自Novagen公司，產品目錄號為71285-3)進行Bt Cry34B融合蛋白產量檢測。檢測結果:結果表明Bt Cry34B融合蛋白產量為0.01335mg蛋白/mg初始菌體。(七)BtCry34B融合蛋白蟲飼實驗將純化得到的Bt Cry34B融合蛋白，用0.l%Triton-100 (V/V)水溶液倍半梯度稀釋成5個濃度，以0.l%Triton-100水溶液溶解的BSA (胎牛血清蛋白)80ug/mL作為對照組。每個濃度設置4重復處理組。將清洗干凈的玉米苗的根浸入稀釋液10秒后室內自然晾干，放入培養皿中，每皿放入30只玉米根蟲的幼蟲，用透氣薄膜封口，在25°C，40%-50%相對濕度黑暗培養箱中放置4天。 之后觀察幼蟲的死亡狀態。結果表明，Bt Cry34B融合蛋白對玉米根蟲幼蟲的LC50值為8.05mg/L。
權利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的編碼基因，其特征在于，具有序列表中SEQ ID Na:1中第5179-5574位核苷酸序列。
2.—種蘇云金芽孢桿菌晶體融合蛋白的編碼基因，其特征在于，具有序列表中SEQ IDNa:1中第5071-5601位核苷酸序列。
3.含有權利要求1或2所述的編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌；所述重組載體優選為重組表達載體或重組克隆載體。
4.一種Bt Cry34B融合蛋白的制備方法，包括以下步驟: 1)將SEQID Na.1中第5173-5580位核苷酸所示序列的DNA片段插入pET28a表達載體中，得到重組表達載體； 2)將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌； 3)培養所述重組菌，并進行誘導表達，收集菌體；裂解菌體，即得。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)包括以下步驟:a)將所述重組菌接種于含有50ug/mLKan的LB培養基，37°C振蕩培養16h，得到培養物； b)將所述培養物按1%的體積接入含50ug/mLKan的LB培養基，37°C振蕩培養3小時，得到培養液 c)向所述培養液中加入IPTG至終濃度為lmM，30°C震搖培養6小時； d)將步驟c)所得產物4°C，IOOOOg離心lOmin，收集菌體。
6.一種蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID Ns.2所示。
全文摘要
本發明公開了一種蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白Bt Cry34B的制備方法。該方法包括如下步驟1)將SEQ ID №.1所示的DNA插入pET28a表達載體中，得到重組表達載體；2)將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌；3)培養所述重組菌，并進行誘導表達，收集菌體；裂解菌體，即得。本發明應用基因工程方法在國內首次合成Bt Cry34B基因，并首次制備出了Bt Cry34B融合蛋白，為進一步探討該蛋白的檢測方法、生理功能及其作用機制、降解機制打下了基礎。
文檔編號C07K19/00GK103233020SQ201310122670
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者王保民, 張威, 譚桂玉, 曹振, 何麗珊, 郭素琴, 張亮, 張瑞 申請人:中國農業大學