專利名稱：：一株殺蟲、抑真菌的蘇云金芽孢桿菌菌株及其應用的制作方法一株殺蟲、抑真菌的蘇云^fS桿難株及其鵬
技術領域：
：本發明屬于植物病蟲害的生物防治
技術領域：
，特別涉及一種既殺鱗翅目害蟲又抑制植物病原真菌的蘇云金，桿菌的篩選方法及活性菌株的制備方法。背景fe^甜m^M鱗翅目夜^f斗，是一種繁殖力很強的M性害蟲，可取食寄主植物多達幾百種，是危害小麥、棉頓多種麟的錢害蟲。每年給我國農業妒帶來巨大的損失。甜菜^生物農藥不敏感，國內夕卜許多學者利用生物農藥與化學農藥復配方法，雖然起到一定的防治作用，但是化學農藥給人類帶來的危害以及害艦化學農藥的抗性在不斷增加。因此篩選具有特異活性的菌株非常必要。由病原真菌弓胞的植物病害降低了植物產品的產量和品質，給農業生產帶來巨大的損失。近年隨著^t種植方法的普及，高溫高濕的環境更利于真菌的繁殖，真菌病害閂趨嚴重。作為生物殺蟲齊啲蘇云金荊包桿菌制劑，從20懇己50年代以來已廣泛用于農、林、果、蔬多種害^tE生害蟲的防治，是防治M目害蟲的主要生物殺蟲劑，它不污染環境，對人畜安全，生產工藝簡單，妒成本低廉。蘇云金芽孢桿菌(5aa7/uW/^/喂'm^簡稱Bt)的殺蟲活性來自其自身合成的殺蟲晶體蛋白，這些蛋白對B具有特異性。在已商品化的Bt菌株中，大多是對棉鈴蟲高效的菌株，鄉甘菜鄉我活性高的較少。故近年來，學者一直在篩選高活性的菌株。BtWY-190菌株對甜菜夜麟力當時是國內外高毒力菌株的34倍，但專利未公布其LCso(閆建平等ZL02115581,X，2002)。具優良基因組合的高效Bt15A3菌株對甜菜夜蛾的半致死濃度(LC50)為15.63ppm(陳月華等ZL01104421.7，2001)。但這些菌株均沒有抑制真菌的活性。楊謙(CN1778886A)利用含有Bt基因的質粒構建抗蟲防病的木霉菌。Mairone等(USpatent6077506)發現一株新型Bt菌株AQ52可以產生抗生素從而抑制多種植物病原真菌及細菌。Moar等(USpatent6280722)分離到一株Bt突，株，對幾種植物病原真抑制作用，并_&^現菌株中具有新的幾丁質驢因。±^菌株具備高效殺甜菜繊的特性。幾丁質酶在環境保護、生物防治和農業等領域有著S^:和潛在的應用價值。除卵菌外所有真菌細胞壁中均含有幾丁質。幾丁質酶可以7K解真菌細M的幾丁質從而抑制真菌生長。幾丁質還是昆蟲中腸圍食膜的主要結構，被幾丁質酶破壞后，力口速害蟲的罹病過程，提高死亡率，因iW殺蟲劑有明顯增效作用。^&桿菌是幾丁質酶的一個重要來源。因此，篩選具有產幾丁質酶且酶活性高的菌株，在抑制病蟲害方面有著錢的細價值。
發明內容本發明的目的是Jlf共一株廣譜抑制真菌、同時翅目夜^#重要害蟲甜菜夜蛾具有高毒殺活性的蘇云金^&桿M株，以及m株的iSffl。該菌株可用于抗真菌病、殺蟲多功能生物農藥的制備。本發明鄉的具有殺蟲、抑真菌的蘇云金魏桿Wif株，已于2008年1月8日^fi于"中國微生物薪中皿管理委員會普通微生物中心"(北京市朝陽區大^S各iooioi，中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCCNo.2327，分類命名為蘇云金^J包桿菌Sa"7toAwn'"g7'mw:y519-1，簡稱Bt519-1。(Bt519-1菌tt^MS晶體形態見圖1照片。)本發明戶脫的Bt519-1，攜帶有a7lM、c^lAb、a^lAc、cyll、cy2和vz》3AAf中殺蟲蛋白編石騷因，以及編碼70kDa幾丁質麟因&氾，是一種具有廣譜抑制植物病原真菌活'膽對鱗翅目害蟲具有高毒力的蘇云金^fe桿菌。所述的植物病原真菌是小麥赤霉病菌、棉^Z1枯病菌、蘋果輪紋病菌、黑曲霉、黃青霉、黃;iy^霉病菌、^f包鐮刀菌和黑根霉；戶;Mii翅目害蟲是甜菜夜蛾、棉鈴蟲。所述的Bt519-1，對8種植物病原真薪f明顯的抑制作用，100%抑制真菌孢子萌發、對甜菜夜蛾半致死濃度(LC50)僅為8.8ug/mL的蘇云金^J包打M株，命名為蘇云金^J包桿菌5""7/usf/n#7"giemis519-1，簡稱Bt519-1(CGMCCNo.2327)。±^菌種可以應用于抑制植物病原真菌及防治鱗翅目害蟲。本發明的優點和積極鄉與現有技^l目比，本發明針對蘇云金桿菌對害蟲普遍作用譜窄、對甜菜夜蛾活性不高且無抑制真菌作用的弱勢，篩選出既殺蟲又抑制真菌的多功能菌株，其孢晶復，凍干粉對甜菜^*我的半致死濃度(LC5o)僅為8.8ug/mL。對8種常見植物病源真菌有明顯的抑制作用，可100%抑制真菌孢子萌發。禾IJ用這一菌株可生產殺蟲抗病的多功能生物農藥，用于防治鱗翅目科重大害蟲甜菜，同時娥直物病源真菌也有抑制作用。l圖1是Bt519-l菌MM^&晶體形態照片。圖2是Bt519-l菌株抑制3種植物病源真菌包子萌發圖示，A、為黑根霉圖示，B、為蘋果輪紋病菌圖示，C、為^m鐮刀菌圖示。圖中顯示，加Bt519-l菌艦真菌孢子的檢測杯沒有真菌生^m，證明孢子萌發數柳制，而加無菌水及真菌孢子的對照杯周圍真菌生長正常。圖3是Bt519-1菌株—3A錄基因PCR產物的電泳檢測結果，l.PCR，；2.標準^量DNAMarker。圖4是Bt519-l菌株c/hB^feS因PCR，的電泳檢測結果，l.PCR，；2.標準好量DNAMarker。具體實|&^:實施例1、多功能菌株Bt519-1的m^抑真菌活性觀啶1丄采*±壤樣品，利用^包桿0M熱的原理，對樣品進行8(TC20min分鐘處理，經培養后用顯微W1察，選出帶有m及晶體的菌株，命名為Bt519-1。1.2.依據GenBank公開的cfeB基因序列設計一對特異弓胸，進行70kDa幾丁質鵬因的PCR檢測，Bt519-1菌株為幾丁質酶c/j氾基因陽'性。13.制備以膠體幾丁質為惟一碳源的固體培養基，其配方為(g/L):膠體幾丁質20，KH2P041，Na3P042，MgS04'7H200.5，KC10.5，瓊月謝15，pH7.2。用于檢測幾丁質酶活性。1.4.用無菌牙簽將Bt519-1菌株點接于J^培養基上，3(TC培養57天。Bt519-1菌株肖,在培養基上生長并產生較力K解圈。1.5.進行抑制8種植物病源真菌活性檢測。方法是在制備好的PDA平板中央接種直徑為8mm的8種植物病源真菌菌塊兒，每一平板接著一種真菌，培養24天，被巨真離絲2cm處接種Bt519-1菌株，3(TC培養5天，觀察Bt519-1對每種真菌的抑帝,用，并測定抑菌圈直徑與細M^直徑之比(R值)。表l是Bt519-l與參比菌株Btl5A3(ZL01104421.7)對8種真菌的抑制效果。_表1、Bt5194茵株Lj參比菌株對8種真茵的抑制效果a_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2、Bt519-l對真菌孢子萌發^tp制活性測定艦牛對不—平板法(Oxfordcup-Plate)檢測菌株Bt519-l對真菌孢子萌發的抑制作用。具體方法是2丄取制備好的PDA平板，每將fchj爐2個無菌書執。其中一個為檢測杯，一個為對照杯。牛津杯材質為不銹鋼，高10mm，外徑8mm，內徑6mm。2.2.取制備好的黑根霉、蘋果微病菌和魏鐮刀菌的孢TM液20ul(約含103孢子)，加入到頓牛辦中。2.3在檢測杯中再加入180uLBt519-1菌體懸液(OD6oo=1.530)，對照杯加入180uL無菌^C。2.4.將平板方爐于28。C溫箱中培養23天后觀mcp制^i萌發的交裸。加Bt519-1菌真菌孢子的檢測杯沒有真菌生設，證明孢子萌發完全受到抑制，而加無菌水及真菌孢子的對照杯周圍真菌生長正常(見附圖2)。實施例3、Bt519-1菌tt^鈴蟲和甜菜,半致死濃度(LC5Q)測定3丄為了精確計算所篩選到的目標菌株Bt519-l辦帛鈴蟲和甜練娥的半致死濃度，將該菌^i歸在普通NB固體培養基上，30。Ci:^72小時后，收集包含有，和晶體蛋白的皿，經冷凍千燥法制成干粉。3.2.將本室臓的、贈帛鈴蟲和甜菜夜蛾高效的專利菌株Btl5A3(ZL01104421.7)作為參比菌株同樣處理。3.3.稱取相同重量的—戰凍干粉，分別系列稀釋成5個濃度，制備相應濃度的感染飼料。3.4.分別接入棉鈴蟲和甜菜繊初孵幼蟲，每一濃度飼喂48頭幼蟲，并設自然死亡對照。3(TC溫箱±咅養72小時，檢查幼蟲在M濃度感^5il料的死亡百分率，換算成死tt幾ffi統計法計算出每一菌株對每一種蟲的LC5o。3.5.戰生物測定每一菌株對每一種蟲重復測定3次。3次結果的平均《舒U于表3中。Bt519-1對棉鈴蟲的毒力約為15A3殺蟲毒力的50%。而對甜菜^!fe我幼蟲的半致死濃度最低的菌株為Bt519-1，僅為8.8ug/mL，比15A3菌株毒力高2倍。表2、Bt519-1菌細帛鈴蟲和甜^i的LC5o測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Bt519-1菌株分離自云南昆明土壤中，辦征是菌體細胞桿狀，大小為1~1.211111乂3511m，兩端鈍圓。可形成內生魏和伴孢晶體，芽繊不膨大，芽孢呈卵圓形。晶體JM^大小多種多樣，有方形、橢圓形、球形、魏、鑲娜和不規則形(見圖l)。晶體由SDS-PAGE法測得肝量大約為130kDa。經特異基因PCR檢領iJ，Bt519-1菌株攜帶的殺蟲蛋白編碼基因有:町lAa^t^lAb,lAc,wjll,和v*3A，還帶有編碼約70kDa幾丁質HS因"氾。圖3、圖4分別為瓊脂撒嫩電泳檢測到的Bt519-1菌株wjo3A和c/z氾基因大小正確的PCR產物。實施例5、Bt519-1菌株的發離養5.1斜面謝NB培養基斜面(叭)牛肉膏5，蛋白胨IO，NaCl5，瓊月謝18,pH7.2~7.4。培養基制備好后^^試管，121。C高壓蒸氣滅菌30併中，取出后擺成斜面，置30。C溫箱培養2448小時，無雜菌生長M以接沐取皿菌種Bt519-1—環接種斜面，30。C培養1012小時，涂片染色后顯微鏡觀察，菌體為粗桿狀，兩纟辭屯圓，原生質均勻，無雜菌。5.2發辭中子培養將J^活化的菌種取一環接入液體NB培養基中，30°C,220rpm/min振蕩培養12小時。5.3發|#咅養發^i咅養基配方(g/L):豆并粉40，玉米淀粉15，酵fi^H0，以及K2HP04MgS04CaCl2MnS04四種無機去跌共5g。^原料需超ij180pim篩的細度，pH8.59.0。按發^t咅養i[容積的十分之一frlR方iA發^t咅養基，滅菌后冷卻至35。C左右，按培養基體積的3%接入上步的種子液，轉數為230250轉，溫度30。OrC，發酵周期3545小時，視2030%左右的芽孢晶體游離，發酷夜pH達8.0以上終ih^酵。5.4利用Jd^方法培養，發MM數可達7xl()9CFU/mL,芽孢晶體同歩釋放率達95%。5.5發酵結束后，加入鹽,發MpH達5.0左右，再加少量防腐劑及其它輔料。5.6J^發,咅養基配方及培養方法可放大為噸位級發,培養。權利要求1、一株殺蟲、抑真菌的蘇云金芽孢桿菌菌株，保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCCNo.2327。2、權利要求l所述的蘇云^ll桿^株，是一種具有廣譜抑制植物病原真菌活MJWM目害蟲具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌，其攜Mc^lAa、c7^1Ab、c/^lAc、ct^11、c^2和v^3AMt殺蟲蛋白編離因，以及編碼70kDa幾丁質縫因cfeB。3、權利要求2戶jM的蘇云金^i桿^株，，征在于0M的植物病原真菌是小麥赤霉病菌、棉粒枯病菌、蘋果微病菌、黑曲霉、黃青霉、黃織霉病菌、娜鐮刀菌和黑根霉；所^!翅目害蟲是甜|1和棉鈴蟲。4、權利要求l所述的菌種在抑制植物病原真菌及防治鱗翅目害蟲中的應用。全文摘要一株殺蟲、抑真菌的蘇云金芽孢桿菌菌株及其應用。本發明菌株為蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis519-1，簡稱Bt519-1，保藏號CGMCCNo.2327，該菌株攜帶有殺蟲蛋白編碼基因cry1Aa，、cry1Ab、cry1Ac、cry1I、cry2及其vip3A以及70kDa幾丁質酶編碼基因chiB。所述菌株的孢晶復合物凍干粉對甜菜夜蛾的半致死濃度(LC<sub>50</sub>)僅為8.8μg/mL，能抑制8種常見植物病源真菌菌絲的生長，可100％抑制真菌孢子萌發。利用這一菌株可生產殺蟲抗病的多功能生物農藥，用于防治鱗翅目重大害蟲甜菜夜蛾和棉鈴蟲，同時對植物病源真菌也有抑制作用。文檔編號A01P7/04GK101245329SQ200810052439公開日2008年8月20日申請日期2008年3月14日優先權日2008年3月14日發明者東劉,亮肖,峻蔡,謝池楚,陳月華,韓苗苗申請人:南開大學