專利名稱：植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA1及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YAl及其編碼基因和應用。
背景技術：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響植物生長、發育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應答與信號傳導機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務之一。在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發育上的變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。在干旱、高鹽和低溫等環境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應的調整，以最大程度上減少環境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節其它相關基因的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環境的抗性。與脅迫相關的基因產物可以分為兩大類第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調節因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物；第二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節的蛋白因子，如蛋白激酶、轉錄因子等。其中，轉錄因子在植物脅迫應答的基因表達調控中起著重要作用。轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性作用的DNA結合蛋白，通過它們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉錄。轉錄因子的DNA結合區決定了它與順式作用元件結合的特異性，而轉錄調控區決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。目前已知在植物中與脅迫相關的轉錄因子主要有具有AP2結構域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應答元件結合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉錄因子家族、含有堿性區域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/ leucinezipper motif transcription factors)類轉錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉錄因子家族、結合CCAAT-box的主要核轉錄因子的CBF(CCAAT binding factor) 類轉錄因子、含有堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇 (Trp cluster)的MTO家族。這些轉錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應外， 其它四個家族均參與調節植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應。其中，NF-Y轉錄因子在高等植物中廣泛存在，近年來，在擬南芥、玉米、水稻均有報道，這表明NF-Y轉錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。NF-Y (核轉錄因子，Nuclear Factor Y)是一種結合CCAAT_box的主要的核轉錄因子，特異的識別并結合許多真核生物組成型、誘導性和細胞周期依賴性基因的啟動子或增強子中的保守序列CCAAT-box，并調控這些基因的轉錄水平的表達。NF-Y是由NF_YA、NF_YB 和NF-YC三個不同亞基組成的三聚體。NF-TO和NF-YC的組蛋白折疊基序(HFM)相互作用使之形成二聚體，然后結合NF-YA形成異源三聚體的NF-Y復合物，從而結合CCAAT-box，調節其靶基因的轉錄。NF-YA至少有兩個結構域用于蛋白質的結合富含谷氨酰胺的結構域 (Q-rich domain)和一個亞基相互作用的結構域(subunitinteraction domain)。NF-YB 也有兩個蛋白結合的結構域組蛋白折疊基序(histone-fold motif)和TATA結合蛋白 (TATA-binding protein)結合結構域(TBP-binding domain)。NF-YC 有三個蛋白質的結合結構域組蛋白折疊基序，TBP結合結構域以及富含谷氨酰胺的結構域。NF-YA和NF-YC 的結構氨基酸序列與組蛋白折疊基序同源，NF-YB與H2B組蛋白折疊基序相關，而NF-YC于 H2A組蛋白折疊基序相關，該基序由三個α螺旋和兩個環組成，負責Η2Α/Η2Β 二聚體的形成。目前，在植物中關于NF-Y轉錄因子的功能的報道較少，都在干旱脅迫中起重要的作用(Nelson et al，2007)。Nelson等認為，與擬南芥AtNF-YBl轉錄因子同源的ZmNF_YB2， 在缺水的條件下過表達ZmNF-YB2的轉基因玉米可以明顯增強抗旱性，由于ZmNF_YB2可以是多個與植物干旱有關參數發生改變，包括葉綠素含量、氣口導度、葉片溫度、減少萎蔫和維持光合作用，從而提高抗旱性(Nelson, Peter P. Repetti, TomR. Adams, Jingrui Wu, 2007)。Wen-Xue Li, Youko Oono等的研究證實，AtNF_YA5的表達受到干旱和ABA處理的誘導。對其啟動子GUS分析表明部分誘導反應發生在轉錄水平。NF-YA5有一個靶位點miR169， 在干旱條件下，miR169表達受到抑制。NF-YA5在微管組織和保衛細胞有很高的表達，因此， 利用一個關鍵性轉錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
發明內容
本發明的目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YAl及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，為一種結合CCAAT-box的核轉錄因子蛋白，名稱為 GmNF-YAl，來源于大豆屬大豆(Glycine max L.)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。序列1所示蛋白質由348個氨基酸殘基組成，自氨基端第213-217位氨基酸殘基序列為可能的核定位信號區，自氨基端第184-240位氨基酸殘基序列為保守的NF-YA結構域。為了使(a)中的GmNF-YAl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因，優選為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA 分子1)序列表中序列2自5’端第2 至1274位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’端第2M至1315位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2自5’端第181至1315位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。
3.含有權利要求2所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為 YEP-GAP-GmNF-YAl 或 pBI12I-GmNF-YAl所述YEP-GAP-GmNF-YAl為將權利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5’端第2M至1315位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述pBI121-GmNF-YAl為將權利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5’端第181至1315位核苷酸所示的DNA片段插入 PBI121的SmaI和McI酶切識別位點之間得到的重組質粒。
5.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2所述基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于權利要求2所述基因通過權利要求3或4所述重組表達載體導入所述目的植物。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐旱。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優選為哥倫比亞生態型擬南芥；所述方法為將權利要求2所述基因通過所述pBI121-GmNF-YAl導入所述目的植物中。
9.擴增權利要求2所述基因或其任意片段的引物對。
10.權利要求1所述蛋白作為轉錄因子的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA1及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明的GmNF-YA1在干旱、鹽、ABA和乙烯的誘導下表達，編碼的蛋白定位到細胞核上。本發明的GmNF-YA1可以提高植物的抗旱性，為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發揮重要的作用。
文檔編號A01H5/00GK102234322SQ20101016169
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者徐兆師, 李連城, 陳明, 馬有志 申請人:中國農業科學院作物科學研究所