植物耐逆性相關蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的應用的制作方法

專利名稱：植物耐逆性相關蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物耐逆性相關蛋白MtMYB在培育耐逆植物 中的應用。
背景技術：
環境中生物因素和非生物因素嚴重制約著植物的生長發育，其中高鹽、干旱、低 溫、臭氧、輻射及重金屬等非生物脅迫已成為主要的影響因素，這些非生物脅迫造成糧食作 物減產量高達50%。植物通過長期的進化，形成了一系列完善的逆境脅迫應答機制，包括細 胞水平的耐受和植株整體水平的協同應答。在應答反應中，轉錄水平的調節是最重要的。植物對高鹽、干旱及低溫耐受性的強 弱往往不取決于某一單一因子，其性狀受許多因子影響。一個轉錄因子可以調控多個與同 類性狀有關的基因的表達，通過增強一些關鍵的調節因子的作用來促進這些抗逆基因資源 發揮作用，使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。在提高作物對環境脅迫的分子育種 中，與導入或改良個別功能基因來提高某種抗性的傳統方法相比，從改良或增強一個關鍵 的轉錄因子調控能力著手，提高作物的抗逆性將是一種更為有效的方法和途徑。因此應用 轉錄因子提高植物的抗逆性研究已經成為當今的研究熱點。由于具有基因組小、染色體數為2X8(2n = 16)、生長期短、自花授粉、根瘤固氮、 遺傳轉化效率高、與豆科主要作物親緣關系較近等特點，截型苜蓿被選作豆科模式植物。研 究表明，非生物脅迫(比如鹽脅迫)會影響植物的結瘤，從而影響固氮，因此截型苜蓿的有 些轉錄因子可能同時參與非生物脅迫和結瘤，這一點與擬南芥存在很大差異。基于以上特 點，截型苜蓿成為研究豆科植物的熱點。

發明內容
本發明的目的是提供植物耐逆性相關蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的應用。本發明提供了來源于截型苜蓿(Medicago truncatula)的未知功能蛋白的用途。本發明保護植物耐逆性相關蛋白MtMYB或其編碼基因在培育耐逆植物中的應用；所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分 子1)序列表中序列2自5，端第8至805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分 子；
4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼耐逆性相關蛋白的DNA 分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、 0. 1 % SDS 和 1 X SSC,0. 1 % SDS 各洗膜一次。本發明還保護一種培育耐逆植物的方法，是將所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的 編碼基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因具體可通過pl302_MtMYB導入所 述目的植物中所述pl302-MtMYB是將所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因插入 pCAMBIAl302的多克隆位點得到的重組質粒。所述耐逆性具體可為耐鹽和/或耐干旱。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物可為如擬南芥，如 Columbia生態型擬南芥。植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因參與截型苜蓿的鹽脅迫和干旱脅迫應答 反應。將植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因導入出發植物，可以得到耐逆性顯著高于 出發植物的轉基因植物，本發明對于培育耐鹽、耐干旱的轉基因豆科作物具有重要價值。目前的研究盡管獲得了許多耐逆相關基因，但是，這些基因大多來自擬南芥、煙草 等模式生物。由于在種屬差異，擬南芥的耐逆基因轉化其他植物，可能因為沒有相應的信號 傳遞通路，而不能提高轉基因植物的抗鹽能力。所以，需要深入研究多種植物的耐逆機制， 挖掘耐逆基因。本發明從豆科模式植物截型苜蓿中通過芯片篩選到一個鹽誘導后表達量顯 著上調的轉錄因子基因MtMYB，通過農桿菌轉化法將MtMYB導入擬南芥，經過潮霉素初篩、 分子檢測、萌發期鹽脅迫和后期干旱脅迫等手段，篩選到抗鹽和抗干旱能力顯著提高的轉 基因擬南芥株系。將該基因導入經濟作物苜蓿等豆科作物對培育耐鹽耐干旱的轉基因豆科 作物有重要價值。


圖1為載體pCAMBIA1302_MtMYB構建流程圖。圖2為T2代轉基因擬南芥的分子水平檢測；(a)為PCR擴增產物電泳圖，1為 IkbDNA ladder,由下到上分別為 250bp、500bp、750bp、lOOObp、1500bp、2000bp，2 為空白對 照，3為陰性對照，4為陽性對照，5-17為PCR陽性植株；(b)為陽性植株的RT-PCR擴增產物 電泳圖。圖3為T3代轉基因擬南芥NaCl脅迫下的萌發率統計圖。圖4為T3代轉基因擬南芥抗干旱檢測結果；(a)表型圖；(b)存活率統計圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量實驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。截型苜蓿2007年 2 月申小葉購自法國 INRA BRC-MTR(Biological ResourceCentre for the model species Medicago truncatula L.)。Columbia生態型擬南芥(哥倫比亞生態型擬南芥；野生型)購自salk公司。農桿菌EHA105 中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻抗生素抑制農桿菌的 效果及對條斑紫菜生長發育的影響，王萍等水產科學，200928 (7)。 實施例1、MtMYB基因的發現通過兩次芯片實驗建立截型苜蓿完善的苜蓿種子萌發期和苗期鹽脅迫基因表 達譜，并對受鹽脅迫顯著誘導的基因進行聚類分析和GO注釋分析，對感興趣的探針進行 GeneBins水平的pathway分類分析，基本構建了苜蓿耐鹽調控網絡框架。在此基礎上建立 截形苜蓿鹽脅迫表達數據庫。本發明從芯片中篩選到一個鹽誘導后表達量顯著上調的轉錄 因子MtMYB，在200mM NaCl誘導5小時后表達量上調20倍。將序列1所示氨基酸殘基組成的蛋白命名為MtMYB蛋白(由265個氨基酸殘基組 成)，將MtMYB蛋白的編碼基因命名為MtMYB基因，其編碼區如序列表的序列2自5’端第8 至805位核苷酸所示。實施例2、轉基因植物的獲得及耐逆性鑒定一、轉基因擬南芥的獲得1、MtMYB基因的克隆(1)設計特異性引物對(MtMYB_5’和MtMYB_3’ )，由Invitrogen公司合成。MtMYB_5' 5' -AGA TCT GAT GAG AGG TAT GGA TAT TAA GGT TC-3'；MtMYB_3，5，-GGA CTA GTT CAC GCA AGT AAA TTG TAT TTT ATT TCA-3，。(2)提取截型苜蓿的RNA，反轉錄為cDNA ；(3)以步驟⑵的cDNA為模板，用步驟⑴的特異性引物對進行PCR擴增，回收 PCR擴增產物。(4)將步驟(3)的PCR擴增產物進行測序。PCR擴增產物的核苷酸序列如序列表 的序列2所示。序列2中，第1-7是Bgl II酶切位點和保護堿基，第8-805是MtMYB基因 序列，第806-813是SpeI的酶切位點及保護堿基。(5)將PCR擴增產物插入pMD18 T-simpIe載體(購自TaKaRa生物工程公司)，得 到載體 PMD18 T-simple-MtMYB。2、重組載體(pl302_MtMYB)的構建構建過程如圖1所示。(1)用限制性內切酶Bgl II和Spe I雙酶切載體pMD18 T-simple-MtMYB，回收小 片段。(2)用限制性內切酶 Bgl II 和 SpeI 雙酶切 pCAMBIA1302 (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture.www.cambia.org), 回收載體骨架。(3)將步驟(1)的小片段與步驟(2)的載體骨架連接，得到重組載體 pl302-MtMYB (在骨架載體pCAMBIA1302的Bgl II和SpeI酶切位點之間插入了序列表的序 列 2 所示的 DNA ；pCAMBIA1302-MtMYB)。3、轉基因擬南芥的獲得(1)農桿菌感受態細胞的制備
挑取農桿菌EHA105單菌落接種于IOOmlYEB液體培養基中，220rpm、28°C振蕩培 養至OD600 = 0 . 5 ；轉入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入IOml預冷的0. 15M的 CaCl2水溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min ；4°C>5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預 冷的含10%甘油(體積百分含量)和0. 15M CaCl2的水溶液，輕輕懸浮；得到農桿菌懸浮液 (EHA105感受態細胞)，分裝于無菌印pendorf管中，每管200 μ 1，于液氮中速凍lmin，凍存 于-70°C。(2)pl302-MtMYB 轉化農桿菌 EHA105取Iyg重組載體pl302-MtMYB加入200μ 1 ΕΗΑ105感受態細胞中，混勻，靜止 5min;液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入Iml YEB液體培養基，28°C、150rpm振蕩培 養4h ；5000rpm離心3min，棄上清，加入0. Iml YEB液體培養基，重新懸浮細胞；涂布于含 50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固體平板上，28°C培養約48h。PCR鑒定陽性克隆，鑒定所用引物如下5，引物5，-ATG AGA GGT ATG GAT ATT AAG GTT C-3，；3，引物5，-TCA CGC AAG TAA ATT GTA TTT TAT T-3，。結果顯示pl302_MtMYB已經成功轉入EHA105中，得到了重組農桿菌。(3)轉化擬南芥①將重組農桿菌接種于IOml含50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB液 體培養基中，28°C、200rpm振蕩培養過夜；②轉化前一天以1 50比例(體積比)接種于200ml含相同抗生素的YEB培養 基中，擴大培養至0D600為1.2-1.6，5，000rpm、15min離心集菌，重懸于滲入緩沖液(由蔗 糖、L-77和水組成；蔗糖的質量百分含量為5%蔗糖，L-77的體積百分含量為0. 05% )，使 0D600為0. 8，即為重組農桿菌菌液；③采用Foral dip法將農桿菌轉化花蕾期的擬南芥在Columbia生態型擬南芥抽 苔4-5cm時剪去頂端花序，使腋生花序生長，剪時傷口應位于最高的莖生葉上方，約4-5天 后進行轉化，轉化前要使土壤充分濕透且將大的花蕾去掉，只保留未開放的小花蕾；轉化時 將擬南芥整株與花盆一起倒扣在盛有200ml重組農桿菌菌液的容器中浸泡2-3min，浸泡完 畢后，取出花盆，側放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行 正常的光照培養，收獲T1代種子。(4)轉基因擬南芥的篩選和分子鑒定①轉基因擬南芥的篩選T1代種子播種于含80mg/L潮霉素的MS固體平板上，4°C春化3天，置22°C光照培 養箱中培養7-10天，轉化體表現為真葉呈深綠色，根深長至培養基中，將轉化體移至不含 抗生素的MS培養基中，6-8天后將綠色的幼苗轉到土壤中繁種，收獲的種子即為T2代種子。②DNA水平檢測將T2代種子培育成植株，以各陽性株系的基因組DNA為模板(質粒pl302_MtMYB 為陽性對照，Columbia生態型擬南芥的基因組DNA為陰性對照，水為空白對照)，用如下引 物進行PCR擴增5，引物5，-ATG AGA GGT ATG GAT ATT AAG GTT C—3，；3，引物5，-TCA CGC AAG TAA ATT GTA TTT TAT T-3，。
PCR體系(25. 0 μ 1) 10 XEx Taq PCR Buffer 2. 5 μ 1，dNTP (25mM) 2. 0 μ 1，5，引物 (5ρ θ1/μ 1)1·0μ 1，3，引物(5ρ θ1/μ 1)1·0μ 1，ExTaq 酶(5U/μ 1) 1· 0 μ 1，模板(1 μ g/ μ 1) 1· 0 μ 1，CldH2O 16. 5 μ 1。PCR 程序為第一輪94°C變性 5min ；第二輪94°C變性 50sec，56°C 復性 50sec, 72°C延伸lmin，30個循環；第三輪72°C延伸IOmin0反應結束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，能擴增出MtMYB基因特異 條帶(約798bp)的植株為PCR陽性植株。結果見圖2(a)。得到13個PCR陽性株系，其中 兩個株系為L21株系和L34株系。③RNA水平檢測為了檢測PCR陽性植株中MtMYB基因是否得到轉錄，進行RT-PCR檢測。Actin2為 參比,檢測 Actin2 基因的引物對如下:5，-GGT AAC ATT GTG CTC AGT GGT GG-3，；5，-AAC GAC CTT AAT CTT CAT GCT GC-3，。a. Trizol法分別提取野生型、L21株系植株和L34株系植株的總RNA ；b.以完整性好、無污染的RNA為模板，用M-MLV酶(購自Promage公司)反轉錄 RNA 為 cDNA ；反轉錄反應體系(15. Ομ ) :RNA(1. 0 μ g/μ 1) 2. 0 μ 1，Oligd T 2. 0μ 1, RNA free H2O至15. 0 μ 1 ；將上述混合物混勻后，短暫離心將之收集于管底，70°C溫育5min，再 立即置于冰上 5min，再加入以下成分5XM-MLV Buffer 5. 0 μ 1，dNTPl. 5 μ 1，RRI (40U/ μ 1)0. 65 μ 1，RTase M-MLV (200U/ μ 1) 1· 0μ 1，H2O 1· 85 μ 1 ；將上述混合物混勻，短暫離心 將之收集于管底，在42°C溫育60min，70°C反應15min，取出置于冰上，離心后儲存于_20°C。c.以0. 5 μ 1反轉錄產物為模板進行PCR擴增，PCR體系及程序與步驟②相同。反應結束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，能擴增出MtMYB基因特異 條帶(約798bp)的植株為RT-PCR陽性植株。結果見圖2(b)。結果表明L21株系和L34 株系確實為轉MtMYB基因植株。將L21株系進行自交，得到T3代種子，將其培育為T3代植株。將L34株系進行自 交，得到T3代種子，將其培育為T3代植株。4、轉空載體對照擬南芥的獲得用pCAMBIA1302代替重組載體pl302_MtMYB，其它同步驟3，得到轉空載體對照擬南芥。二、轉基因擬南芥的耐逆性鑒定分別將Columbia生態型擬南芥(WT)種子、L21株系擬南芥(T3代種子)、L34株 系擬南芥(T3代種子)和轉空載體對照擬南芥(T3代種子)進行鹽脅迫實驗和干旱脅迫實 驗，每個株系90粒種子。1、鹽脅迫實驗將擬南芥種子種于含有220mM NaCl的MS培養基上，4°C春化72hr，光照培養7天， 進行萌發率計算(以根長Imm為萌發標準)。統計結果如圖3所示。Columbia生態型擬南 芥種子的萌發率是40. 17%，L21種子的萌發率為76. 85%, L34種子的萌發率為63. 30%, 轉空載體對照擬南芥種子的萌發率與Columbia生態型擬南芥相同。L21擬南芥和L34擬南 芥種子的萌發率顯著高于Columbia生態型擬南芥和轉空載體對照擬南芥，表明MtMYB基因 增加了擬南芥的抗鹽能力。
2、干旱脅迫實驗將擬南芥種子種于種于MS培養基上，4°C春化72hr，光照培養7天，轉移到培養土 (營養土 蛭石=1 1)，分成干旱處理組和對照組干旱處理組饒水3周后，干旱處理(不澆水)2周，復水4天后拍照，并計算存活率。對照組正常澆水，與干旱處理組同時拍照并統計存活率。照片見圖4(a)，存活率統計結果見圖4(b)。L21和L34擬南芥的長勢顯著優 于Columbia生態型擬南芥，轉空載體對照擬南芥與Columbia生態型擬南芥的表型一致。 Columbia生態型擬南芥的存活率是17.71%，L21的存活率是21. 42%，L34的存活率是 77. 53%，轉空載體對照擬南芥的存活率為與Columbia生態型擬南芥相同。L34擬南芥的存 活率顯著高于Columbia生態型擬南芥，表明MtMYB基因增加了擬南芥的抗干旱能力。
權利要求
植物耐逆性相關蛋白MtMYB或其編碼基因在培育耐逆植物中的應用；所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基 因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第8至805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。
3.一種培育耐逆植物的方法，是將植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因導入目的植 物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物；所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基 因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第8至805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基 因通過pl302-MtMYB導入所述目的植物中所述pl302_MtMYB是將所述植物耐逆性相關蛋 白MtMYB的編碼基因插入pCAMBIA1302的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽和/或耐干旱。
7.如權利要求3至6中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或 雙子葉植物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了植物耐逆性相關蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的應用。植物耐逆性相關蛋白MtMYB或其編碼基因可用于培育耐逆植物，所述植物耐逆性相關蛋白MtMYB是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。植物耐逆性相關蛋白MtMYB的編碼基因參與截型苜蓿的鹽脅迫和干旱脅迫應答反應，將該基因導入出發植物，可以得到耐逆性顯著高于出發植物的轉基因植物，本發明對于培育耐鹽、耐干旱的轉基因豆科作物具有重要價值。
文檔編號C12N15/29GK101885764SQ20101023954
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者張運芹, 王濤, 胡曉娜, 董江麗 申請人:中國農業大學