專利名稱：中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法
技術領域：
本發明涉及一種中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法。
技術背景
中華鱘(Acipenser sinensis Gray)為典型的河海洄游魚類，國家一級保護動物。 目前，利用野生中華鱘親魚開展人工繁殖放流已成為該物種保護的重要措施之一，但由于 酷漁濫捕、水域污染和水利工程建設等人為活動造成其自然資源不斷衰退，中華鱘已處于 瀕危等級。在野生中華鱘人工繁殖過程中常常遇到雄魚不足和雄魚與雌魚性腺發育不同步 的問題，利用超低溫冷凍保存技術把中華鱘精子長期有效的保存起來，待遇到成熟的雌性 中華鱘親魚，即可對精液解凍，并與成熟魚卵進行人工授精，以解決雌雄親魚性腺發育不同 步的問題。國外關于其它魚類精液超低溫冷凍保存研究的報道較多，相關技術也較為成熟， 國內也有關于中華鱘精液超低溫冷凍保存研究的報道，但有關利用中華鱘超低溫冷凍精液 人工授精操作方法尚未見報道。現有技術的缺點(1)國內鱘魚的人工繁殖研究保護工作起步較晚，采用冷凍精液進行人工授精作 為人工繁殖的輔助措施，目前僅限于研究探索階段，尚未應用到生產實踐中。(2)國內外尚未見有關中華鱘冷凍精液人工授精操作方法的報道。
發明內容
為了克服上述缺陷，本發明提供一種中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法，掌握 一種可應用于生產有效的中華鱘凍精人工授精操作方法。本發明采用以下技術方案方案1 中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法，步驟如下(1)采集中華鱘雄魚的精子，進行冷凍保存；(2)輕壓中華鱘腹部能擠出卵或發現中華鱘產卵時開始對冷凍精子解凍；(3)卵子產出后，立即與解凍精子進行人工授精凍精授精采用不同激活溶液分 步進行激活授精，即將300ml卵子加入5ml解凍精子快速混合，隨即加入激活溶液(10-20mM Tris,5-10mM NaCl，0· 1-0. 25mM KCl，pH 8. 5) 50ml 激活，柔和攪拌 20 秒后，再次加入解凍 精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合攪拌，20秒后加入孵化用水攪拌，然后 加入10%滑石粉脫粘，孵化用水沖洗后，將同批受精卵歸并同一孵化篩中進行孵化。上述超低溫冷凍精液是在-196°C的超低溫保存的優質中華鱘凍精。本發明具有如下優點1、凍精分步激活授精方法有助于提高凍精活力，提高受精率；2、該方法已在野生中華鱘人工繁殖生產和子代中華鱘全人工繁殖生產中得到良 好應用，可有效解決當前中華鱘人工繁過程中雄魚不足、雌雄親魚不能同步成熟的問題，為通過人工增殖方式對中華鱘進行保護，提供有力的技術支撐；3、本發明中所采用的激活溶液配方能夠提高受精率和孵化率；4、該方法也適用于其他鱘魚類的冷凍精液人工授精。
具體實施例本發明的技術方案具體實施例如下。在中華鱘人工繁殖過程中常常會遇到雄魚不足的問題，該專利通過利用超低溫冷 凍保存技術把中華鱘精子進行長期有的效保存，以解決雌雄親魚性腺發育不同步及充分利 用有限資源，從長遠來講對中華鱘資源的恢復和保護具有十分重要的意義。該實驗是通過 利用超低溫冷凍保存技術保存的子一代中華鱘精子進行了人工繁殖實驗和效果分析，旨在 完善中華鱘全人工繁殖技術體系，為更好地保護中華鱘種質資源提供技術支撐。實施對象-196 °C超低溫保存的中華鱘優質凍精。精卵來源用于全人工繁殖的中華鱘精液子與卵子，來自中華鱘研究所在純淡水條件下馴養 的性腺發育成熟的子一代中華鱘雄魚和雌魚各一尾，分別于2009年9月29日和2009年11 月22日采用促黃體釋放激素類似物(LRH-A2)對成熟的雄魚和雌魚進行注射催產，催產水 溫度為18. 8-19°C，采取擠壓法采集精子和卵子；精液在保鮮袋中充氧后于2-4°C冰箱內保 存，經超低溫冷凍投入液氮中保存，人工繁殖實驗時冷凍精子再解凍與子一代中華鱘成熟 鱘卵進行人工授精。精子冷凍及解凍利用離心管和裝有液氮的液氮罐，取活力大于90%的鮮精按體積比1 3與 2-4°C的抗凍稀釋液混合，平衡lOmin，分裝1. 5ml離心管，采用二步降溫法，即距液氮面上 2-3cm處平衡IOmin后，沉入液氮罐底部保存。精液在液氮中保存53天后取出，于38_40°C 水浴解凍lmin。解凍后的精液于2-4°C的冰箱中保存，待鏡檢。凍精活力鏡檢及激活劑篩選根據鱘魚凍精的生理特性分別采用蒸餾水和以Tris、NaCl, CaCl 12、MgCl2, KCl 及D-Glucose (葡萄糖)等各組分不同配比配制不同濃度的激活劑激活凍精，通過激活凍精 活力鏡檢效果評價篩選凍精激活劑。解凍精子人工授精雌鱘自催產達效應時間，輕壓腹部能擠出卵或發現鱘魚產卵時開始解凍冷凍精 子，并同時采集卵子。將凍精從液氮中取出，于38-40°C水浴鍋中Imin解凍，取少量精液涂 在載玻片上，滴加適量的蒸餾水混勻激活，立即在顯微鏡下觀察精子的活力，選取激活率大 于65%凍精與采集的卵子進行授精。凍精激活授精采用激活溶液(IOmMTris, IOmM NaCl,0. ImM KCl，pH 8. 5)和 20mM 葡萄糖激活溶液分步激活授精，即300ml卵子加入5ml解凍精子快速混合，隨即加入激活劑 50ml激活，輕輕攪拌20秒后，加入解凍精子5ml混合，20秒后加入20mM葡萄糖溶液混合攪 拌，20秒后加入孵化水攪拌，然后加入10%滑石粉脫粘，孵化用水沖洗后，將同批受精卵歸 并同一孵化篩中進行孵化，發育至原腸期后統計受精率和孵化率。
在本次子一代中華鱘凍精授精實驗的應用中，成功的獲得了凍精受精的鱘魚苗，結果表明利用超低溫冷凍保存技術將精子長期有效保存起來，解決中華鱘在人工繁殖過程 中雌雄親魚性腺發育不同步問題，充分利用有限親魚資源進行繁殖的途徑是可行的，為完 善中華鱘全人工繁殖技術體系，更好地保護中華鱘種質資源提供有力的技術支持。
權利要求
一種中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法，其包括如下步驟(1)采集中華鱘雄魚的精子，進行冷凍保存；(2)輕壓中華鱘腹部能擠出卵或發現中華鱘產卵時對冷凍精子進行解凍；(3)卵子產出后，立即與解凍精子進行凍精人工授精，凍精授精采用不同激活溶液進行分步激活授精即將300ml卵子加入5ml解凍精子快速混合，隨即加入激活劑50ml激活，柔和攪拌20秒后，加入解凍精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合攪拌，20秒后加入孵化用水攪拌，然后加入10％滑石粉脫粘，孵化用水沖洗后，將同批受精卵歸并同一孵化篩中進行孵化。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將采集的精子經超低溫冷凍直接投入液氮 中保存。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，授精的水溫度為18.8-19°C。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，精子的冷凍采用離心管和裝有液氮的液氮 罐，取活力大于90%的鮮精按體積比1 3與2-4°C的抗凍稀釋液混合，平衡lOmin，分裝 1.5ml離心管，采用二步降溫法，即距液氮面上2-3cm處平衡IOmin后，直接投入液氮中冷凍保存。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，精子的解凍是將精液從液氮中取出， 38-40°C水浴Imin即可解凍，解凍后的精液在2_4°C冰箱存放。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活劑配方(1)10-20mM Tris,5-10mM NaCl，0· 1-0. 25mM KCl, ρΗ 8.5;(2)10-20mMD-Glucose。
7.根據凍精的生理特性和不同激活溶液的功能差異采用分步激活授精方法，有肋于提 高凍精活力，提高凍精受精率。
全文摘要
一種中華鱘超低溫冷凍精液人工授精方法，其包括如下步驟(1)采集中華鱘雄魚的精子，進行冷凍保存；(2)輕壓中華鱘腹部能擠出卵或發現中華鱘產卵時開始解凍冷凍精子；(3)卵子產出后，立即與解凍精子進行凍精人工授精，凍精授精采用不同激活溶液進行分步激活授精，即將300ml卵子加入5ml解凍精子快速混合，隨即加入激活溶液(10-20mM Tris，5-10mM NaCl，0.1-0.25mM KCl，pH 8.5)50ml激活，柔和攪拌20秒后，再次加入解凍精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合攪拌，20秒后加入孵化用水攪拌，然后加入10％滑石粉脫粘，孵化用水沖洗后，將同批受精卵歸并同一孵化篩中進行孵化。
文檔編號A01K61/00GK101836615SQ20101018463
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者萬建義, 田家元, 舒德斌, 郭柏福 申請人:中國長江三峽集團公司中華鱘研究所