專利名稱：豬骨骼肌特異性表達基因α-actin啟動子的克隆及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及到豬中骨骼肌特異性表達基因 α -actin的不同長度啟動子區域的分離鑒定及功能驗證。
背景技術：
高等生物基因的表達受到細胞內外環境的精細調控，因而具有嚴格的時間及空間有序性。基因的表達調控是一個復雜且有序的過程，由多階段調控水平共同完成，這主要包括轉錄前、轉錄、轉錄后、翻譯、翻譯后五個水平。其中轉錄水平的調控是最關鍵的環節。啟動子是轉錄水平上一個重要的調控元件，是位于結構基因5'端上游區的DNA序列，可與眾多的轉錄因子相互作用調控基因的表達(武力，1999)。因此深入研究啟動子的結構、功能、 作用模式等有利于我們更好的理解相應基因的功能及基因間的互作關系。根據啟動子作用方式及功能的不同可將啟動子分為3類組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子是指在該類啟動子的調控下，基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織部位表達水平沒有明顯差異。誘導型啟動子是指在某些特定物理或化學信號的刺激下，該種類型啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。組織特異性啟動子是指在該類啟動子的調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達， 并表現出發育調節的特征。外源基因在機體中能否高效穩定地表達是基因工程研究的關鍵。在真核細胞中利用基因工程技術構建多種真核表達系統進行外源基因的表達已經是一項常用的技術，但是經常面臨的問題是外源基因的表達量較低，且表達往往存在于機體的幾乎所有組織中，如現階段廣泛利用的CMV及SV40啟動子。兩者均可以攜帶外源基因與幾乎所有類型的細胞中高效地表達。這兩種高效的啟動子存在的問題是顯而易見的不具備調控基因靶向表達于某一特定組織的能力。能夠解決此問題的關鍵乃是具備較高活性的組織特異性啟動子的獲得。組織特異性啟動子通常以特定的組織細胞結構和化學、物理信號為基礎，可對外源基因進行靶向定位，將基因固定于某一組織或細胞中表達，減少了機體能量和物質的損耗及對機體代謝活動的影響，同時又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類疾病的治療方面的前景尤其可觀。鑒于組織特異性啟動具備這樣的特質，在基因工程中越來越獲得研究者的青睞。利用肌肉特異性啟動子，通過構建相應的表達載體，能夠開啟基因固定于肌肉中表達。通過外源基因的蛋白或RNAs在骨骼肌中的表達可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的質量。例如可利用肌肉特異性的啟動子攜帶目的MicroRNA特異性的靜默其靶基因在肌肉中的表達而不影響其他組織此基因的正常表達，有效的獲得目的基因對于肌肉組織的作用；同時可以利用肌肉組織特異性的啟動子來研究那些通過QTL圖譜定位及表達分析獲得的可用于提高肌肉量的候選基因。但其肌肉的缺點是表達效率較低，個體間差異較大，所以，提高外源基因在肌肉組織中的表達具有重要的意義。在人類中肌動蛋白家族主要包含六個異構體，他們之間在氨基酸水平上達到90%
3以上的相似性(Sieterline等，1998 ；Tondeleir, et al.，2009)。肌動蛋白在細胞中發揮著各種各樣的功能β-actin和Y-actin是細胞內細胞骨架的主要成分，對于細胞形態的維持及細胞的運動性方面發揮著舉足輕重的作用(Sieterline等，1998 ；Tondeleir等，2009 ； Vandekerckhove and Weber，1978)。其余四種異構體主要存在于平滑肌，心肌及骨骼肌中， 維持著肌肉的收縮功能(Tondeleinet al.，2009)。骨骼肌actin和心肌actin共表達于各種橫紋肌中(Ilkovski等，2005 ；Tondeleir等，2009)。骨骼肌a-actin所編碼的蛋白質是成年的機體骨骼肌中肌動蛋白的主要異構體，是肌原纖維節的細肌絲的核心部分，同其他的諸多蛋白發生相互作用，最顯著的是同粗肌絲的肌球蛋白發生作用，從而引起肌收縮 (Craig and I^dr0n，2004)。在成年機體的骨骼肌中，骨骼肌actin是主要的蛋白異構體 (Sheterline等，1998)。研究表明豬的α -actin定位于14號染色體，DNA為2739bp，cDNA 為1474bp，ORFlliMbp，編碼378個氨基酸。從目前在植物中及動物中獲得的啟動子分析發現，普遍存在以下幾個方面的問題特異性并不是很高；分離并且獲得應用的特異性啟動子并不是很多，限制了在基因工程中的應用；活性低。特別是在動物上的研究還比較欠缺。因此，獲得特異性較強表達效率較高的啟動子成為亟待解決的問題。到目前為止，除申請人之外，仍沒見到研究豬肌肉組織骨骼肌基因α-actin的啟動子功能的報道。所以申請人對這個基因進行了不同長度啟動子功能的研究，以期能夠更好地利用該啟動子。
發明內容
本發明的目的在于分離克隆豬的骨骼肌特異性表達基因α -actin啟動子區域的不同片段，并對其進行功能驗證，以期獲得此基因的具備較高啟動活性并保持肌肉組織特異性的調控區段。克服目前動物基因工程中可利用的組織特異性啟動子數目的不足。本發明從大白豬的基因組中分離并鑒定出α-actin基因具有肌肉組織特異性的啟動子。以大白豬的血液基因組DNA為模板擴增獲得了 1758bp、1446bp、1202bp、 1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp共8個不同長度的缺失啟動子片段，將這些片段融合報告基因螢火蟲熒光素酶基因(簡稱LUC基因)構建pGL3-basiC-Ql、pGL3-basiC-Q2、 pGL3-basic-Q3> pGL3-basic-Q4> pGL3-basic-Q5> pGL3-basic-Q6> pGL3-basic-Q7> pGL3-basic-Q88個真核表達載體，將這些載體分別轉染C2C12JK及分化的C2C12細胞，通過雙熒光素酶報告系統分析報告基因螢火蟲熒光素酶的相對活性，從而獲得保持肌肉組織特異性的核心啟動子區。本發明通過以下技術實現本發明的技術路線見圖1所示。利用BLASTn數據庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov)搜索獲得骨骼肌特異性基因a-actin的上游調控序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。利用TESS、TFSEARCH 及Methl^imer生物信息學軟件預測分析核心啟動子區域、順反式作用元件及CpG島分布情況。根據預測結果設計8對缺失引物(其核苷酸序列見表1)，利用PCR法從大白豬的基因組中分離獲得肌肉組織特異性啟動子。構建報告基因LUC融合載體，申請人將其分別命名為 pGL3_basic_Ql、pGL3_basic_Q2、pGL3_basic_Q3、pGL3_basic_Q4、pGL3_basic_Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3_basic-Q7、pGL3_basic-Q8。其片段長度分別為 1758bp、1446bp、 1202bp、1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp，其核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9所示。瞬時轉染C2C12、H(及分化的C2C12細胞，雙熒光素酶報告系統檢測發現 pGL3_basic_Ql、pGL3_basic_Q2、pGL3_basic_Q3、pGL3_basic_Q4、pGL3_basic_Q5、 pGL3-basiC-Q6僅在分化的C2C12細胞中有微弱的表達，在其余兩種細胞中的表達量同陰性對照pGL3-basic無顯著性差異。pGL3_basic-Q7和pGL3_basic-Q8的活性在C2C12及分化C2C12中有了極大的提高，同上述前六種載體的活性相比而言有極顯著的差異，在Hi細胞中并無明顯變化。結果顯示249bp的pGL3-basiC-Q8片段具備獨立的啟動報告基因表達的功能并同時保持著肌肉組織的表達特異性。本發明的具體步驟如下在前人研究的基礎上選擇具備骨骼肌特異性的表達基因α -actin，在美國國立生物研究所網站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上獲得該基因的DNA序列，如SEQ ID NO :10所示，以此序列作為探針序列，利用比較基因組學的方法，將該DNA序列輸入NCBI的 BLASTn數據庫，搜索獲得該基因的上游調控序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。利用TESS、TFSEARCH及MetUrimer等生物信息學軟件對序列SEQ ID NO 1預測其核心啟動子區域、順反式作用元件及CpG島分布情況。根據網絡預測的結果設計缺失引物，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增獲得8個不同長度的啟動子區域，序列分別如序列表SEQ ID NO :2-SEQ ID N0:9所示。將這些啟動子候選片段裝載到pGL3-basiC報告基因LUC上游多克隆位點(載體圖及多克隆位點等信息見圖2)處，裝配成融合表達載體(圖3)。通過脂質體介導的轉染法將融合表達載體瞬時轉入C2C12、PK及分化的C2C12細胞，同時轉入海腎熒光素酶報告基因pRL-TK為內參質粒。本發明設置陰性對照pGL3-basiC (圖2)， 陽性對照pGL3-C0ntr0l。轉染4 后通過雙熒光素酶報告系統對報告基因LUC進行定量分析，進而考察驗證該啟動子的不同缺失片段在不同來源細胞中的啟動功能。檢測結果表明 pGL3_basic_Ql、pGL3_basic_Q2、pGL3_basic_Q3、pGL3_basic_Q4、pGL3_basic_Q5、 pGL3-basic-Q6僅在分化的C2C12細胞中有微弱的表達，在其余兩種細胞中的表達量同陰性對照pGL3-basic無顯著性差異。pGL3_basic-Q7和pGL3_basic-Q8的活性在C2C 12及分化C2C12中有了極大的提高，同上述前六種載體的活性相比而言有極顯著的差異，在Hi 細胞中并無明顯變化。結果顯示M9bp的pGL3-basiC-Q8片段具備獨立的啟動報告基因表達的功能并同時保持著肌肉組織的表達特異性。本發明的優點在于(1)本發明詳盡的驗證了 α-actin啟動子的各個區段在不同來源細胞中啟動基因表達的能力，為α-actin基因的表達調控帶來了更深層次的認知。(2)本發明鑒定了肌肉組織特異表達的啟動子α -actin的核心區段，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》的內容。
序列表SEQ IDNO :1，公開了本發明克隆的豬骨骼肌特異表達基因α -actin的上游調控核苷酸序列，長度為2006bp。序列表SEQ ID NO :2是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Ql的核苷酸序列，長度為1758bp。序列表SEQ ID NO :3是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q2的核苷酸序列，長度為1446bp。序列表SEQ ID NO :4是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q3的核苷酸序列，長度為1202bp。序列表SEQ ID NO :5是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q4的核苷酸序列，長度為ll^bp。序列表SEQ ID NO :6是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q5的核苷酸序列，長度為1070bp。序列表SEQ ID NO :7是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q6的核苷酸序列，長度為896bp。序列表SEQ ID NO 8是從所述的SEQ IDNO 1核苷酸序列克隆得到的一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q7的核苷酸序列，長度為MObp。序列表SEQ ID NO :9是從所述的SEQ ID NO 1核苷酸序列克隆得到一個缺失啟動子pGL3-basiC-Q8的核苷酸序列，長度為M9bp。序列表SEQ ID NO 10是本發明克隆的豬的骨骼肌特異表達基因α-actin的上游調控序列的探針DNA序列(Genebank登錄號為1001M254)的，長度為2739bp。圖1 本發明的技術路線圖。圖2 表示載體pGL3-basiC結構示意圖，在多克隆位點的下方包含報告基因luc+。圖3 構建好的以pGL3-basiC為骨架的融合載體簡圖。骨骼肌特異表達基因 α -actin的啟動子系列缺火片段來驅動LUC基因表達，由圖中的deleted promoter來表示。Amp為氨芐抗性篩選基因；Iuc+為報告基因螢火蟲熒光素酶；MCS表示多克隆位點；箭頭方向表示基因或啟動子表達的方向。
4 ffi ^ i(； # pGL3-basic-Q U pGL3-basic-Q2, pGL3-basic-Q3, pGL3_basic_Q4、pGL3_basic_Q5、pGL3_basic_Q6、pGL3_basic_Q7、pGL3_basic_Q8 的 KpnI 和BglII雙酶切鑒定圖。M表示DL marker2000，l-8分別表示融合載體pGL3-basic-Ql、 pGL3-basic-Q2> pGL3-basic-Q3> pGL3-basic-Q4> pGL3-basic-Q5> pGL3-basic-Q6> pGL3-basic-Q7,pGL3-basic-Q8的雙酶切結果，上面較大的條帶為載體條帶，下端為缺失啟動子條帶，條帶長度分別為 1758bp、1446bp、1202bp、1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp。圖5 由骨骼肌特異表達基因α -actin的系列缺失啟動子驅動LUC基因在不同來源的細胞中的表達情況。
具體實施例方式實施例1 豬的骨骼肌特異性表達基因α -actin的啟動子候選片段及相應缺失片段的獲得利用報道的豬的α -actin基因的DNA序列(GenBank登錄號:100154254)為探針序列，在 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/)提取候選基因 ATG 前的 2006bp 的上游序列作為啟動子候選片段。通過設計特異性引物(PlF :CCATCTGGAGGAAGCACG ；PlR CCACGATGGACGGGAACA)，以大白豬的血液基因組DNA為模板，PCR擴增此段序列。擴增條件為94 "C 5min, 35* (94 "C，40sec, 57. 8 "C 40sec, 72 "C，lmin30sec) ；72 °C，IOmin ；25 °C， 2min。擴增產物用1.5%瓊脂糖電泳檢測，回收純化(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作)，做TA克隆，連接體系為PCR產物5μ L ligation Solution I 1. 5 μ L ；載體pMD18_T Vector (購自寶生物工程大連有限公司)0.3yL。后挑選陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。將測序正確的陽性克隆擴大培養，抽提質粒(根據TIANGEN公司的TIANpreMiniPlasmidKit操作)，命名為 TA-2006，置于-20°C備用。利用TESS、TFSEARCH及MetUrimer等生物信息學軟件預測此段候選序列的核心啟動子區域、順反式作用元件及CpG島分布情況。根據網絡預測的結果設計缺失引物(引物序列如表1所示；PCR反應參數設置如表2所示)。其中P2F、P3F、P4F、P5F、P6F、P7F依次代表構建的6個5'端缺失載體的前向引物，添加酶切位點Kpn I(GGTACC，以下劃線表示)，同時攜帶保護性堿基GG(陰影表示)；P8R表示公共的后向引物，添加的酶切位點為 BglII (AGATCT，以下劃線表示)，同時攜帶保護性堿基GA(以陰影區表示)；P9R、PlOR表示構建的2個3'端缺失載體的后向引物，添加酶切位點BglII (以下劃線表示)，P4F表示其公用的前向引物，添加酶切位點Kpnl(以下劃線表示)。PCR擴增模板為測序正確的TA-2006 質粒。得到擴增產物之后，后續操作均按構建TA-2006的方法進行，將該載體分別命名為 TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6、TA-Q7、TA-Q8。表1 啟動子缺失載體引物的設計
權利要求
1.調控豬肌肉組織骨骼肌特異表達基因α-actin的一個肌肉組織特異性表達的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
2.調控豬肌肉組織骨骼肌特異表達基因α-actin的一個肌肉組織特異性表達的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示。
3.權利要求1或2所述的啟動子在豬的遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及到豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin的不同長度啟動子區域的分離鑒定和功能驗證。從豬的基因組中克隆了骨骼肌特異表達基因α-actin(GeneBank登錄號為100154254)上游八個個不同長度的啟動子，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO2-SEQ ID NO9所示；結果表明長度為249bp的區域具有獨立的啟動活性兼肌肉組織特異性，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO9所示。本發明同時公開了八個不同缺失啟動子片段的獲得、相應重組表達載體的制備方法及雙熒光素酶活性檢測系統對啟動子活性分析的應用。
文檔編號A01K67/027GK102453716SQ20101051858
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者劉京鴿, 蔣思文 申請人:華中農業大學