來源于大豆的根特異性啟動子GmPRP2p-1062及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種來源于大豆的根特異性啟動子GmPRP2p-1062及其應用。
【背景技術】
[0002] 啟動子是基因的組成部分，控制基因表達的起始和表達程度。在轉基因育種中，夕卜 源基因在植物體中的精確調控主要是通過合適的啟動子實現的。目前，在基因工程中廣泛 使用的是組成型啟動子，但是由于組成型啟動子驅使目的基因在植物組織中的表達是恒定 和持續的，不受時空和外界因素的限制，會過度消耗細胞內的物質和能量，產生大量異源蛋 白質或代謝產物，破壞了植物原有的生理代謝平衡，導致植物生長異常甚至死亡。與組成型 啟動子相比，根特異性啟動子它所驅動的外源基因在受體植物根中表達，克服了組成型啟 動子由于持續、高效的啟動外源基因非特異性表達而造成的細胞物質的過度消耗。隨著轉 基因植物安全標準的提高，包括所有商業化轉基因農作物在內，要求必須對所用啟動子的 表達活性、潛在重組能力、對周邊環境以及安全性影響進行詳細的研究。
[0003] 大豆是一種重要的糧油飼兼用作物，在我國大豆產區大多處于干旱、鹽堿及高寒 等區域，應用的大豆品種耐逆性不強，嚴重的旱澇病蟲害等非生物和生物逆境脅迫顯著影 響大豆產量。目前在轉基因大豆中使用的都是CaMV35S啟動子，根特異啟動子應用到大豆 轉基因中，為大豆轉基因研究提供更加豐富的啟動子元件，同時也為培育耐旱、耐鹽、耐冷 等轉基因大豆新品種提供一種手段。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種具有啟動子功能的DNA分子。
[0005] 本發明所提供的具有啟動子功能的DNA分子，來源于豆科大豆屬栽培大豆 (Glycine max (L. ) Merr. ) Williams82,命名為 GmPRP2p_1062,是下述 a)-c)中任一 DNA 片段：
[0006] a)序列表中序列2所示的DNA片段；
[0007] b)與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；
[0008] c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片 段。
[0009] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 其中，序列表中序列2由1062個核苷酸組成，為序列1的第1-1062位。
[0011] 含有所述DNA分子(啟動子)的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本 發明的保護范圍。
[0012] 在本發明中，所述重組載體為在pC13Pl載體的多克隆位點（如Sac I和Xba I )插 入含有所述DNA分子的DNA片段后得到的重組質粒。
[0013] 進一步，所述重組載體按照如下方法獲得：將所述DNA分子與PEASY-Tl載體相連， 得到中間載體；用限制性內切酶Sac I和Xba I雙酶切所述中間載體，將還有所述DNA分子 的酶切片段與同樣經過限制性內切酶Sac I和Xba I雙酶切的所述pC13Pl載體的骨架片 段相連，得到所述重組載體。
[0014] 所述pC13Pl載體是以pCAMBIA1301載體為基礎改造得到的環形載體，所述pC13Pl 載體上不含有任何啟動子的序列，用來滿足研究啟動子功能的需要。
[0015] 具體而言，所述PC13P1載體的序列如序列表中序列3所示。
[0016] 所述表達盒可以由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的 目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所 述目的基因與所述轉錄終止序列連接。
[0017] 在本發明的一個實施例中，所述目的基因具體為⑶S基因（來源于所述PC13P1載 體）；所述轉錄終止序列具體為NOS轉錄終止子(來源于所述pC13Pl載體)。
[0018] 所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0019] 在所述應用中，所述表達為根特異性表達。
[0020] 進一步，所述根特異性表達可為根中高表達，具體為根中的表達量顯著高于其他 組織(如葉柄、葉片主脈、花、果莢外殼)。在其他組織中只存在微量的表達。
[0021] 在所述應用中，所述目的基因可為GUS基因。所述植物可為雙子葉植物或單子葉 植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥或大豆。
[0022] 在本發明的一個實施例中，所述植物具體為擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. ) Columbia。
[0023] 另外，擴增所述DNA分子(啟動子）的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0024] 在本發明中，擴增所述DNA分子(啟動子）的引物對為如下：
[0025] 5'-ATTTTCCGGACAAACTCTGG-3' ；
[0026] 5'-GGTTTCTCACGTTGTAGTTG-3' 。
[0027] 實驗證明，本發明所提供的GmPRP2p_1062啟動子，能夠有效啟動目的基因在根中 的特異性表達。本發明為植物在根部的分子改良提供了一種手段，對植株的抗逆研究就有 一定意義，在農業領域具有廣闊的應用空間和市場前景。
【附圖說明】
[0028] 圖1為第一輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條帶。
[0029] 圖2為第二輪PCR產物GmPRP2p-1062的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條 帶。
[0030] 圖3為重組質粒pEASY-GmPRP2p-1062和pC13Pl載體的Sac I和Xba I雙酶切電 泳圖。其中，泳道M為DL2000的DNA分子量標準；泳道1、2分別為pEASY-GmPRP2p-1062和 PPC13P1。
[0031] 圖4為pC13Pl載體的質粒圖譜。
[0032] 圖5為pC13 (Delta)⑶S載體的質粒圖譜。
[0033] 圖6為轉pCAM-PRP2p-1062擬南芥T1代的分子檢測結果。其中，泳道M為 DL2000pIus的DNA分子量標準；泳道CK+為陽性對照；泳道CK-為陰性對照；其他泳道分別 為不同轉基因株系，有目的條帶(箭頭所示位置）出現的為陽性。
[0034] 圖7為轉pCAM-PRP2p-1062擬南芥T3代的營養生長階段不同發育時期GUS染色 結果。
[0035] 圖8為轉pCAM-PRP2p-1062擬南芥T3代的生殖生長階段不同發育時期GUS染色 結果。
[0036] 圖9為轉pCAM-PRP2p-1062擬南芥T3代的植株根和葉中的⑶S活性定量測定結 果。其中，WT表示未轉基因的野生型擬南芥Columbia ;P1062-9、P1062-14、P1062-16是三 株鑒定陽性的轉pCAM-PRP2p-1062擬南芥植株。
【具體實施方式】
[0037] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0038] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039] 下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。下述實施例中的 引物合成及測序工作均由華大公司完成。
[0040] 栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82 :記載于"許碩·野生大豆鹽脅迫 相關microRNA的功能分析.2011年中國農業科學院碩士論文"一文，由中國農業科學院作 物科學研究所供給。
[0041] pC13Pl載體和pC13 (Delta)⑶S載體：均為環形載體，由中國科學院亞熱帶農業 生態研究所Pedro S. C. F. Rocha研究員提供。pC13Pl載體上不含有任何啟動子，但含有⑶S 報告基因(如圖4) ;pC13 (Delta)⑶S載體不含有⑶S基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素 抗性(如圖5)。所述pC13Pl載體的序列如序列表中序列3所示；所述pC13 (Delta)⑶S載 體的序列如序列表中序列4所示。
[0042] 擬南芥（Arabidopsis thaliana(L. )Heynh. ) Columbia :記載于"郭曉 麗.Columbia型擬南芥愈傷組織培養研究.河南農業科學，2009年01期"一文，由中國農 業科學院作物科學研究所供給。
[0043] 根癌農桿菌GV3101 :記載于"趙湛，李文生.不同根癌農桿菌菌株類型對木霉菌 遺傳轉化效率的影響.北方園藝，2006年03期" 一文，由中國農業科學院作物科學研究所 供給。
[0044] 實施例1、GmPRP2p全長啟動子的克隆及序列測定
[0045] 以栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82為材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因組DNA。根據大豆基因組數據庫查找PRP2基因及其上游序列，設計特異引物上游 引物Fl和下游引物R1，以提取的總DNA為模板，進行PCR擴增。
[0046] Fl :5' -ATTTTCCGGACAAACTCTGG-3'（序列 1 的第 1-20 位）；
[0047] Rl :5'-TGGGGGGTTTTCAACTGG-3'（序列 1 的第 1219-1236 位的反向互補序列），
[0048] 反應程序：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，35 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0049] 反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。
[0050] 結果見圖1，其中，泳道M為DL2000的DNA分子量標準，泳道1為PCR產物。用回收 試劑盒純化回收PCR產物，PCR產物回收后與pEASY-Tl載體(全式金公司，目錄號：CT101) 連接，連接產物轉化E. coli感受態細胞DH5a (TIANGEN，目錄號：CB101)，提取質粒，經PCR 擴增為陽性的重組質粒送去測序。測序結果表明，PCR產物為1236bp，如序列1所示，其中 包括174bp PRP2基因 CDS序列（序列1的第1063-1236位）。
[0051] 為了得到不含PRP2基因 CDS序列的啟動子片段，從翻譯起始密碼子ATG開始，新 設計了一條下游引物R2進行第二輪PCR擴增，以第一輪PCR產物(序列1)為模板，以Fl和 R2為引物進行第二輪PCR擴增。
[0052] Fl :5' -ATTTTCCGGACAAACTCTGG-3'（序列 1 的第 1-20 位）；
[0053] R2 :5' -GGTTTCTCACGTTGTAGTTG-3'（序列 1 的第 1043-1062 位的反向互補序列）。
[0054] 反應程序：94°C 5min ;94°C 30s，52°C 30s，72°C 2min，35 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0055] 反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。
[0056] 結果見圖2,其中，泳道M為DL2000的DNA分子量標準，泳道1為PCR產物。用回 收試劑盒純化回收PCR產物，PCR產物回收后與pEASY-Tl載體連接，連接產物轉化E. coli 感受態細胞DH5ci，提取質粒，經PCR擴增為陽性的重組質粒送去測序。測序結果得到了 1062bp的GmPRP2p全長啟動子序列，如序列2所示，命名為GmPRP2p-1062。將測序正確的 重組質粒命名為pEASY-GmPRP2p-1062。
[0057] 實施例2、含有GmPRP2p-1062啟動子的重組表達載體的構建
[0058] 將實施例1獲得的pEASY-GmPRP2p-1062進行Sac I和Xba I (pEASY-Tl載體上自 帶酶切位點)雙酶切，回收酶切產物，將所得回收片段分別與經過同樣雙酶切的PC13P1載體 (質粒圖譜如圖4所示）的骨架大片段相連(酶切圖譜如圖3所示)，獲得重組質粒。將經酶 切鑒定正確的質粒送樣測序。將經測序表明在PC13P1載體的多克隆位點Sac I和Xba I 之間插入含有序列表中序列2的DNA片段的重組質粒命名為pCAM-PRP2p-1062。
[0059] 在重組表