專利名稱：一種刺槐的繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養的方法，特別涉及刺槐離體培養和植株再生的方法，屬于刺槐的組織培養領域。
背景技術：
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又稱洋槐，屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科刺槐屬(Robinia L.)，落葉喬木，原產于美國，天然分布于美國東部阿柏拉契山脈 (Appalachian. Mt.)和奧薩克山脈(Ozank. Mt. ),20世紀初期引入我國，引進后得到迅速擴大栽植，是黃河中下游、淮河流域、海河流域、長江下游諸省的主要用材林、薪炭林、水土保持林、海提及河提防護林，僅在河北、河南、山東和山西等6省市就有40億株。它生長速度快，是重要的速生用材樹種，其木材材質堅硬、抗壓強度大、具較強的耐旱性、防腐力強。刺槐根系長有大量根瘤，可以通過生物固氮增加土壤肥力，在維持生態平衡、提高林分質量等方面發揮重要作用。刺槐的葉片含有粗蛋白，是優質廉價的家畜飼料資源。刺槐花營養豐富，雖花期較短但花量可觀，除直接使用外，還可生產花蜜、提取香料等。
中國對刺槐的育種研究始于20世紀70年代，至今已取得很多成就，但仍不能滿足林業生產的需要。體細胞胚再生途徑是對樹木進行繁育和遺傳改良的重要平臺，也是實現基因轉化的常用再生體系。體胚發生技術具有繁殖數量多、速度快、不受親緣關系限制、一旦形成結構完整的體細胞胚一般都可直接萌發形成小植株等特點，是穩定高效的植物再生體系。此外，體細胞胚胎由單細胞起源，發育程序與合子胚相似，可作為胚胎學研究的模式系統，對細胞全能性表達過程和細胞分化機理等理論問題的研究也具有重要意義。Laine E 和Dumet D成功將加勒比松和油棕胚性愈傷組織在超低溫下保存并保持了體胚發生潛力， 解凍后仍能繼續培養形成植株，這為挽救瀕危植物提供了可能。刺槐的離體培養研究從20 世紀50年代末開始，80年代以后達到高潮。
到目前為止，刺槐通過形成層培養、莖培養、葉片培養、未授粉子房的培養等已獲得了完整的植株，但這些研究都集中在器官發生途徑，通過體細胞胚發生途徑的研究還很少。例如，紅艷以刺槐成熟種子的子葉為外植體，對刺槐體胚培養和誘導不定芽進行了研究，但體細胞胚發生率最高也僅有36. 7 %。
大量研究表明，外植體的發育時期是影響體細胞胚發生的關鍵因素，未成熟合子胚因其細胞全能性高、脫分化容易，在誘導體細胞胚發生時具有顯著優勢。大多數植物離體培養普遍采用未成熟合子胚外植體，但過于幼嫩或過度成熟的合子胚的體胚誘導率并不理想。在整個合子胚的發育過程中，只有一個較短的階段具有很強的體胚發生潛能。目前，研究合子胚發育階段對體細胞胚誘導影響的研究很多，但就刺槐而言，由于刺槐的體細胞胚培養比較困難，表現為體胚誘導率低、畸形胚數量多、體胚質量不高等，制約了其遺傳改良的程度，也阻礙了優良無性系的高效繁殖和快速推廣。目前，國內外對刺槐的體細胞胚培養的研究相對較少，國內尚未見相關報道，國外僅Merkle et al.和Arrillaga et al.發表了這方面的研究結果。其中，Merkle等人從開花后第1周開始，每隔一周從3棵刺槐樹上選取未成熟合子胚為外植體，以MS培養基為基本培養基，研究了外植體胚齡對體胚誘導的影響，僅從開花后4周的一粒未成熟合子胚上觀察到體細胞胚發生，其體細胞胚的誘導率低； ArriIlaga等人在Merkle的研究基礎上提高了體細胞胚的誘導率，以FM培養基為基本培養基，采用開花后1-4周的為成熟合子胚為外植體，進行體細胞胚誘導培養，試驗結果表明開花后2-3周的外植體體胚誘導率最高，僅達到12%。上述研究均是以開花后1-4的未成熟合子胚為外植體進行誘導培養，其誘導率低，最高誘導率僅為12 %，難以滿足刺槐繁殖和育種的需要，因此，建立刺槐高效體胚發生體系勢在必行。發明內容
本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題提供一種新的刺槐離體培養和植株再生的方法，該方法的刺槐體細胞胚誘導率高、體胚萌發率高，可以在較短時間內形成大量優良的刺槐試管苗，可進行規模化、工廠化生產，可用于刺槐轉化體系研究，也可以用于分子育種研究。
為實現上述目的，本發明一方面提供一種刺槐繁殖方法，包括如下順序進行的步驟
1)采集刺槐莢果；
2)將刺槐莢果進行表面滅菌處理后取出其合子胚，獲得無菌合子胚；
3)將無菌合子胚接種到愈傷組織誘導培養基上，進行愈傷組織誘導培養，獲得愈傷組織；
4)將愈傷組織接種于體細胞胚誘導培養基上，進行體細胞胚誘導培養，獲得原胚培養物；
5)將原胚培養物接種于體細胞胚成熟培養基中進行體細胞胚的成熟培養，獲得體細胞胚；
6)將成熟的體細胞胚接種于萌發培養基上進行萌發培養，獲得體胚苗；
7)將體胚苗接種于壯苗培養基上進行壯苗培養，促進體胚苗的生長，獲得試管壯苗；
8)將試管壯苗進行煉苗、移栽，即得。
本發明中所述體細胞胚簡稱體胚。
刺槐的外植體胚齡對愈傷組織的誘導率影響顯著，過嫩或過熟的幼胚均不能得到理想的胚性愈傷組織誘導結果。本發明通過大量的實驗發現，處于開花后第25天至第75 天這一時間段內的刺槐莢果作為外植體，其胚性愈傷組織誘導效果相比于其它時間段內的莢果有明顯的提高；進一步的實驗發現，采集處于刺槐開花后第45天至第65天這一時間段內的莢果作為外植體的繁殖效果有進一步的提高，采用處于刺槐開花后第55天至第65天這一時間段內的莢果作為外植體的繁殖效果得到了更進一步的提高，采用處于開花后第陽天的刺槐莢果作為外植體取得了最好的繁殖效果采集刺槐開花后第陽天的莢果中的未成熟合子胚在所有誘導培養基上的出愈率均高于其它時期的外植體，其愈傷組織誘導率為 66. 72-95. 42%、誘導得到的愈傷組織生長速度快，呈淡黃色或嫩黃綠色，結構緊密，呈顆粒狀，經多次繼代仍能保持較高的活力；其體細胞胚誘導率為76. 88-90. 73%，體胚萌發率為 80-100%，均明顯高于其它時段的外植體，所以本發明最優選采集處于開花后第55天的刺4槐莢果作為外植體。
其中，步驟2)中所述滅菌處理包括如下順序進行的步驟
A)將采集的刺槐莢果用無菌水洗凈后，用酒精浸泡莢果后，用無菌水沖洗干凈；
B)用HgCl2溶液浸泡莢果，用無菌水沖洗干凈；
C)吸干莢果表面水分后從莢果中取出合子胚，即得。
特別是，步驟A)中所述的酒精的體積百分比濃度為75%;浸泡時間為30s ；無菌水沖洗3-5次。
特別是，步驟B)中所述HgCl2溶液的質量百分比濃度為0. 1 % ；浸泡時間為 3-7min，優選為5min ；無菌水沖洗5_6次。
其中，步驟3)中所述的愈傷組織誘導培養基是MS基本培養基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MEQ500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3_6mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；進一步優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸1. 0-5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 3-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；更進一步優選為MS基本培養基 +MES500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸5. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6g/L，pH 值為 5.8。
特別是，步驟幻中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為洸士2°C。
尤其是，愈傷組織誘導培養過程中的相對濕度為60-75%。
其中，步驟4)中所述體細胞胚誘導培養基是MS基本培養基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-2. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/ L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-1. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；進一步優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 5mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L， pH值為5.8。
特別是，步驟4)中所述體細胞胚誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為洸士2°C。
尤其是，體細胞胚誘導培養過程中相對濕度為60-75%。
其中，步驟幻中所述的體細胞胚成熟培養基為MS基本培養基+水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
特別是，步驟5)中所述體細胞胚成熟培養在以下條件下進行培養溫度為 ^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。
尤其是，體細胞胚成熟培養過程中相對濕度為60-75%。
其中，步驟6)中所述的萌發培養基為MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH 值為5.8。
特別是，步驟6)中所述萌發培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。
尤其是，體細胞胚萌發培養過程中相對濕度為60-75%。
其中，步驟7)中所述壯苗培養基為MS基本培養基+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
特別是，步驟7)中所述壯苗培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。
尤其是，體胚苗壯苗培養過程中相對濕度為60-75%。
其中，步驟8)中所述的煉苗、移栽包括如下順序進行的步驟打開培養瓶的瓶蓋， 在移栽室中煉苗1天；然后將試管苗取出，用自來水洗凈根部殘留的瓊脂培養基，移栽到刺槐無土栽培基質中進行移栽培養，移栽培養5-6周后再定植于大田。
特別是，還包括將試管苗放置于遮光50%的自然光光照強度下培養5-10天后再打開培養瓶瓶蓋。
特別是，所述刺槐無土栽培基質由珍珠巖、蛭石組成，其中珍珠巖與蛭石的體積之比為1 1。
特別是，移栽培養是自然光光照條件下，培養5-6周
尤其是，移栽培養溫度為25士5°C、相對濕度為56-90%。
本發明的刺槐的繁殖方法具有以下優點
1、本發明利用刺槐未成熟合子胚進行離體快速繁殖，每個培養階段所采用的基本培養基的都是MS基本培養基，具有無機鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀和銨的含量高，可以為組織生長提供所需礦質營養和促進體細胞胚誘導、分化和萌發生長。
2、本發明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，愈傷組織誘導培養基中添加植物生長調節劑利于外植體的愈傷組織的誘導、增殖，愈傷組織誘導率高，可達到95. 42%
3、本發明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，體細胞胚誘導培養基中添加植物生長調節劑利于體細胞胚從愈傷組織上進行誘導、增殖、成熟，萌發和分化，本發明中使用的刺槐培養基中營養物質組成合理，用量和配比適宜，培育結果重復性高，再生體系穩定，體細胞胚的誘導率高，可達到90. 73%。
4、本發明方法培育的刺槐再生苗生長健壯、繁殖系數高，成熟體細胞胚萌發率高， 達到80-100% ；體胚苗移栽成活率高，達到100%，是工廠化大規模生產刺槐植株的簡便、快捷的技術體系。
圖1是刺槐未成熟合子胚誘導培養得到的愈傷組織；
圖2是刺槐愈傷組織誘導培養得到的原胚培養物；
圖3是原胚培養物的薄層切片的顯微鏡觀測照片；
圖4是刺槐原胚培養物進行成熟培養初期得到的初期培養物；
圖5是刺槐原胚培養物通過成熟培養得到的成熟的體細胞胚；
圖6是刺槐成熟體細胞胚萌發培養得到的體胚苗；
圖7是刺槐體胚苗壯苗培養得到的具有多個莖葉端的叢生試管壯苗；
圖8是刺槐體胚苗壯苗培養過程中繼代培養得到的具有優勢主干的試管壯苗；具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
實施例1
一、試驗材料
1、本發明以北京市延慶米家堡苗圃生長良好的二倍體刺槐實生苗群體為取材資源，選取10棵生長良好、干型較直、結實率高的母樹(各株之間的間隔大于50米)，在2010 年6月到9月間，采集開花后第4-12周的刺槐不同發育階段的合子胚作為外植體試驗材料，每間隔10天采集一次，每次采集500個莢果，即采集開花后25、35、45、55、65、75天的莢果，每次采集500個莢果，將當天采集的莢果在冰盒中低溫保存帶回實驗室，之后放在4°C 的冰箱里冷藏備用。
2、植物生長調節劑
本發明中所使用的植物生長調節物質采用國產萘乙酸(NAA)、6_芐氨基腺嘌呤 (6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和吲哚丁酸(IBA)。
3、培養基的配制
(1) "MS基本培養基”的組成或配制方法；
表IMS 培養基(Murashige and Skoog, 1962)
權利要求
1.一種刺槐繁殖方法，包括如下順序進行的步驟1)采集刺槐莢果；2)將刺槐莢果進行表面滅菌后取出其合子胚，獲得無菌合子胚；3)將無菌合子胚接種到愈傷組織誘導培養基上，進行愈傷組織誘導培養，獲得愈傷組織；4)將愈傷組織接種于體細胞胚誘導培養基上，進行體細胞胚誘導培養，獲得原胚培養物；5)將原胚培養物接種于體細胞胚成熟培養基中進行體細胞胚的成熟培養，獲得體細胞胚；6)將成熟的體細胞胚接種于萌發培養基上進行萌發培養，獲得體胚苗；7)將體胚苗接種于壯苗培養基上進行壯苗培養，促進體胚苗的生長，獲得試管壯苗；8)將試管壯苗進行煉苗、移栽，即得。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的刺槐莢果是處于刺槐開花后第25天至第75天這一時間段內的刺槐莢果，優選為處于刺槐開花后第45天至第65天這一時間段內的刺槐莢果，更優選為處于刺槐開花后第陽天至第65天這一時間段內的刺槐莢果，最優選為刺槐開花后第陽天的刺槐莢果。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導培養基是MS基本培養基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-6. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤 0-3. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
4.如權利要求1或3所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為^±2°C。
5.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述體細胞胚誘導培養基是MS基本培養基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸 0. 1-2. Omg/L+6-芐氨基腺嘌呤 0-1. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
6.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述體細胞胚誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為^±2°C。
7.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述的體細胞胚成熟培養基為MS基本培養基+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。
8.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟6)中所述的萌發培養基為MS基本培養基 +蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。
9.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟7)中所述壯苗培養基為+吲哚丁酸0.2mg/ L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L。
10.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述體細胞胚成熟培養、步驟6)中所述萌發培養或步驟7)中所壯苗培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗；步驟8)中所述的煉苗移栽包括如下順序進行的步驟打開培養瓶的瓶蓋，在移栽室中煉苗1天；然后將試管苗取出， 用自來水洗凈根部殘留的瓊脂培養基，移栽到刺槐無土栽培基質中進行移栽培養5-6周后再定植于大田。
全文摘要
本發明公開了一種刺槐的繁殖方法，以不同胚齡的合子胚為外植體，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+瓊脂為胚性愈傷組織的誘導培養基；以MS基本培養基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-芐氨基腺嘌呤+蔗糖+瓊脂為體細胞胚誘導培養基，通過對愈傷組織的誘導，形成球形胚后將其轉接到MS+水解酪蛋白培養基上，進行體細胞胚的成熟培養，然后轉接到MS基本培養基上萌發形成完整小植株。本發明方法中愈傷組織誘導率、體細胞胚誘導率、萌發率高，可以在短期內形成大量優良的刺槐試管苗，可進行規模化、工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK102499086SQ201110340118
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者習洋, 孫宇涵, 孫鵬, 戴麗, 李云, 李允菲, 王歡, 胡瑞陽, 袁存權 申請人:北京林業大學