一種核桃青皮的提取物及其抑菌用途
【專利摘要】本發明公開了一種核桃青皮提取物，該提取物的制備方法為：稱取核桃青皮，磨碎成漿狀，按1g∶2-5ml的比例加甲醇，超聲提取20-40min，過濾，殘渣用同法再提取2次，合并3次濾液，濃縮、干燥，即得。該提取物對人參根腐病菌具有明顯的抑制作用。
【專利說明】一種核桃青皮的提取物及其抑菌用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種藥物植物的提取物，尤其是一種核桃青皮的提取物及其抑菌用途，屬于中藥或藥物用植物領域。
【背景技術】
[0002]核桃青皮又名青龍衣，是核桃未成熟時外部的一層厚厚的綠色果皮，隨著核桃逐漸成熟青果皮會漸漸變黑，最后自然脫落。它是一種有毒物質，正常人服用過量會導致死亡。據相關資料記載，核桃葉、枝、青皮、樹皮都有藥用價值，具有殺菌、消毒、利尿、滋補、解毒等功效。但關于核桃青皮在農業病蟲害防治方面卻報道得較少。
[0003]根腐菌是一個廣泛分布的土壤病真菌，會傳染木本植物引起根部腐爛與潰瘍。它需要潮濕的土壤與溫暖的溫度，特別容易侵害敏感植物(例如夏季干旱受損的植物)。根腐菌威脅林業、園藝業與水果業，超過900個木本多年生的樹種會被傳染，進而造成族群消減。目前防治根腐菌主要依靠農藥，但使用農藥不可避免地會有毒性殘留，并且施藥過程也會對土壤、人員造成一定的傷害。因而，研發一種安全無殘留的根腐菌防治藥物具有極高的農業應用價值。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種藥用植物提取物，特別是一種核桃青皮提取，用于防治根腐菌等菌類。本發明目的是通過以下技術方案實現的。
[0005]一種核桃青皮提取物，其特征在于該提取物是按如下方法制得的:稱取核桃青皮，磨碎成漿狀，按Ig: 2-5ml的比例加甲醇，超聲提取20-40min，過濾，殘渣用同法再提取2次，合并3次濾液，濃縮、干燥，即得。
[0006]優選的，上述提取物是按如下方法制得的:稱取核桃青皮100g，磨碎成漿狀，加入甲醇250ml，超聲提取30min，減壓抽濾，殘渣用同法再提取2次，合并3次抽濾液，濃縮、干燥，即得。
[0007]進一步地，上述方法所得的甲醇提取物還可以用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇進一步萃取純化，得到相應的提取物。比如，稱取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加A 100ml蒸餾水，裝入分液漏斗中，混合均勻；采用液-液分配萃取法依次用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次(100ml/次)；分別合并各極性萃取液，旋轉蒸發儀濃縮得濃縮液，適量無菌水溶解得提取物。
[0008]以上述方法獲得的各提取物，對菌類，尤其是真菌具有明顯的抑制作用，以下實驗例用于說明其效果。
[0009]有益效果
[0010]I材料與方法
[0011]1.1試驗儀器、材料及試劑
[0012]九陽粉碎機、布式漏斗、RE-6000多功能旋轉蒸發器；ZHJH-C型智能型垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；LS系列立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫療設備有限公司)；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
[0013]核桃青皮采自北京市密云縣。選取外表新鮮干凈的青皮核桃，剝下核桃果實的外青皮，用于后續不同極性提取物的制備。
[0014]人參根腐病菌C.destructans由中國醫學科學院藥用植物研究所提供。
[0015]其余試劑為分析純。
[0016]1.2試驗方法
[0017]1.2.1提取物制備
[0018]準確稱取核桃青皮100g，用植物粉碎機磨碎成漿狀。放入1000ml錐形瓶，用250ml甲醇浸泡，超聲提取30min。提取物經抽濾，殘渣再用250ml甲醇提取，重復2次。合并3次抽濾液，用旋轉蒸發器濃縮得濃縮液。
[0019]稱取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸餾水，裝入分液漏斗中，混合均勻。采用液-液分配萃取法依次用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次(100ml/次)。分別合并各極性萃取液，旋轉蒸發儀濃縮得濃縮液，適量無菌水溶解得提取物水溶液(表 I)。
[0020]表1供試提取物樣品
編號樣品名~
I 乙醚提取物4乙酸`乙酯提取物
[0021]2 石油醚提取物5甲醇提取液
3 氯仿提取物6正丁醇提取物
[0022]1.2.2 PDA培養基制備:取200g去皮馬鈴薯，切成小塊后加I L水，沸水煮30min，雙層紗布過濾，濾液加20g葡萄糖、20g瓊脂粉，用蒸餾水定容至1L。取錐形瓶以IOOmL分裝，于121 °C高溫濕熱滅菌20min，作為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。
[0023]1.2.3抑菌試驗
[0024]分別向15ml事先滅菌的PDA培養基中加入7.5ml,0.25ml,25 μ I和2.5 μ I不同極性的核桃青皮提取物水溶液，充分混勻后倒平板。然后在垂直流超凈工作臺的無菌環境下接種人參根腐病菌，培養10天后，用十字交叉法統計人參致病菌的菌落直徑。每種處理設置3次重復。
[0025]1.2.4統計分析
[0026]試驗結果用Excel軟件(2003版)進行數據處理，利用SPSS 11.0中的單因素方差分析(One-way AN0VA)結合LSD法對統計結果進行顯著性方差分析。不同處理間不含相同英文字母表示差異顯著(P < 0.05)，含有相同英文字母表示差異不顯著(P > 0.05)。
[0027]2試驗結果
[0028]2.1低濃度提取物水溶液的抑菌效果
[0029]先吸取0.25ml提取物原液，再與15ml的PDA培養基混勻，相當于60倍的稀釋液培養基；另通過10倍稀釋法獲得600倍和6000倍的稀釋液培養基。在研究發現，處理2(石油醚水溶液)和處理6 (正丁醇水溶液)中的高濃度(60倍稀釋)樣本與中(600倍稀釋)、低濃度(6000倍稀釋)樣本間存在顯著性差異；另外，處理2中的高濃度(60倍稀釋)和中濃度(600倍稀釋)樣本以及處理6中的高濃度(60倍稀釋)樣本與對照存在顯著性差異。除處理2和處理6外，其他處理與對照均無顯著性差異。
[0030]2.2高濃度提取物水溶液的抑菌效果
[0031]先向PDA培養基中加入等體積的提取物水溶液，充分混勻后倒平板，制成I倍稀釋液培養基。研究發現，處理2與處理5之間，以及二者與對照之間均存在顯著性差異。特別值得關注的是，處理5中的人參根腐菌均未生長，說明該濃度的提取物對致病菌存在顯著的抑制活性。處理1、處理3與處理4之間無顯著性差異，三者與處理2、處理5及對照間存在顯著性差異。
[0032]3 結論
[0033]石油醚和正丁醇萃取物在較高濃度(60倍稀釋液)下，對人參根腐菌有顯著的抑制作用，其余4種萃取液無顯著抑菌活性；但在高濃度(I倍稀釋)下，乙醚、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和甲醇萃取物均有顯著的抑菌活性，且甲醇提取物對人參根腐病菌的抑制效果最佳，抑制率達100%。
【具體實施方式】
[0034]實施例1:核桃青皮甲醇提取物的制備
[0035]準確稱取核桃青皮100g，用植物粉碎機磨碎成漿狀。放入1000ml錐形瓶，用250ml甲醇浸泡，超聲提取30min。提取物經抽濾，殘渣再用250ml甲醇提取，重復2次。合并3次抽濾液，用旋轉蒸發器濃縮，即得。
[0036]實施例2:核桃青皮石油醚提取物的制備
[0037]準確稱取核桃青皮100g，用植物粉碎機磨碎成漿狀。放入1000ml錐形瓶，用250ml甲醇浸泡，超聲提取30min。提取物經抽濾，殘渣再用250ml甲醇提取，重復2次。合并3次抽濾液，用旋轉蒸發器濃縮得浸膏。
[0038]稱取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸餾水，裝入分液漏斗中，混合均勻。采用液-液分配萃取法依次用石油醚萃取3次(100ml/次)，合并萃取液，旋轉蒸發儀濃縮后即得。
[0039]實施例3:核桃青皮乙醚提取物的制備
[0040]準確稱取核桃青皮100g，用植物粉碎機磨碎成漿狀。放入1000ml錐形瓶，用250ml甲醇浸泡，超聲提取30min。提取物經抽濾，殘渣再用250ml甲醇提取，重復2次。合并3次抽濾液，用旋轉蒸發器濃縮得浸膏。
[0041]稱取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸餾水，裝入分液漏斗中，混合均勻。采用液-液分配萃取法依次用乙醚萃取3次(100ml/次)，合并萃取液，旋轉蒸發儀濃縮后即得。
【權利要求】
1.一種核桃青皮提取物，其特征在于該提取物是按如下方法制得的:稱取核桃青皮，磨碎成漿狀，按Ig: 2-5ml的比例加甲醇，超聲提取20-40min，過濾，殘渣用同法再提取2次，合并3次濾液，濃縮、干燥，即得。
2.根據權利要求1所述的提取物，其特征在于該提取物是按如下方法制得的:稱取核桃青皮100g,磨碎成衆狀,加入甲醇250ml,超聲提取30min,減壓抽濾,殘洛用同法再提取2次，合并3次抽濾液，濃縮、干燥，即得。
3.根據權利要求1或2所述的提取物，其特征在于獲得的甲醇提取物還可以用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇進一步萃取純化。
4.權利要求1至3中任一項所制得的核桃青皮提取物在抑菌上的用途。
5.權利要求1至3中任一項所制得的核桃青皮提取物在抑制真菌上的用途。
6.權利 要求1至3中任一項所制得的核桃青皮提取物在抑制人參根腐病菌上的用途。
【文檔編號】A01N65/08GK103766409SQ201210395987
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2012年10月18日
【發明者】王涵, 張益銘, 李翹楚 申請人:王涵, 張益銘, 李翹楚