一種利用lamp檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測方法

專利名稱：一種利用lamp檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測 方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
雜色鮑養殖自2001年開始，人工繁殖幼苗在附苗后10-21天陸續發白、脫落及 大量死亡，影響種苗來源與成貝價格，危及整個鮑養殖產業。養殖鮑苗脫落或成鮑死亡 疫情，不僅發生于中國南方沿海，中國臺灣沿海一帶亦發生類似疾病。經過長時間的監 測研究，確定引起此大規模"掉板癥"的主要病原是溶珊瑚弧菌Vibrio corallilyticus,屬 于弧菌科弧菌屬。 為防止該病原菌的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷溶珊瑚弧 菌是減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢 測方法對于疾病的預防意義重大。 目前常用的檢測技術是以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技 術，但是這些檢測技術在實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術 需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點；熒光實時定量聚合酶 鏈式反應技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜 的定量測定儀器，不適用于現場快速檢測，而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒 光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度；免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要 求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。
所以及時運用生物技術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高 具有重要意義。環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP技術)，
是近年來新出現的一種體外擴增特異DNA片段的技術，具有快速、敏感、特異性強等特 點，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區段，在聚合酶和等 溫條件下高效、快速、高特異地擴增靶序列，擴增反應結束后，通常是采用染色劑對反 應產物進行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶， 如BstDNA聚合酶。 對LAMP來說，4種特異性引物的設計是其關鍵所在，對于引物設計有許多的要 求，如各個引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩定性等，因此從200 300個堿基的 靶序列中設計四條符合要求的引物存在很大的難度。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，該引物組在 很大程度上減少了擴增反應的背景影響，大大改善了溶珊瑚弧菌檢測的特異性。
本發明的目的還在于提供利用上述引物組進行LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診 斷試劑盒，該試劑盒檢測靈敏度高、擴增時間短，產率高。 本發明的目的還在于提供利用上述試劑盒進行LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法， 該方法具有快速、高效和高特異性等特點。 為達到本發明的第一個目的，本發明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物
組，所述的引物組由下述外引物對和內引物對組成 所述的外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內引物對為 其中W = A和T ; R = A和G。 本發明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，它含有下述引物
組、陽性對照品、LAMP反應液、BstDNA聚合酶和顯色液。 所述的引物組由下述外弓I物對和內弓I物對組成 所述的外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內引物對為 其中W二A和T; R二A和G。 所述引物組中外引物對和內引物對的添加摩爾比為1 : 1 10。所述LAMP反應液含有1 X反應緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 l.Ommol/
L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04。所述的IX反應緩沖液含有20mmol/LpH為8.8的Tris-HCl、 1Ommol/L KCl、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04和占反應緩沖液體積百分比為0.1 % Triton X-IOO。
所述的顯色液為含熒光染料，所述的熒光染料優選SYBR Green I或EvaGreen。
所述的陽性對照品為含有溶珊瑚弧菌的基因組DNA。
上述試劑盒的生產工藝，包括如下步驟 (1)將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，分裝后 抽樣質檢； (2)將LAMP反應液無菌分裝，抽樣質檢； (3)將BstDNA聚合酶無菌分裝，抽樣質檢； (4)將顯色液無菌分裝，抽樣質檢； (5)將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢； (6)準備帶有小孔的泡沫板； (7)組裝試劑盒。
作為本發明的具體實施方式
，上述泡沫板的設計可以為其大小與本發明試劑 盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑小管數量的小孔，這樣試劑盒中所 用試劑分裝成的小管可以分別對應放置于這些小孔中，從而使得試劑都能處于小管的下 部，方便取用和吸取，也可以使取用時殘留在管壁上的液體自動回到管底，節約試劑。
本發明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法，該方法包括以下步驟提 取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反應體系中加入上述引物組、LAMP反應液、Bst DNA聚合酶，混勻，進行恒溫擴增反應后進行滅活，取滅活后部分產物進行瓊脂糖凝膠 電泳分析，剩余產物加入顯色液，觀察顯色結果，并同時對比陽性對照品的顯色結果， 若顯示結果一致，則說明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結果不一致，則說明待測 樣品中不含有溶珊瑚弧菌。 所述的引物組由下述外弓|物對和內弓|物對組成 所述的外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內引物對為 其中W二A和T; R二A和G。所述的恒溫反應的溫度范圍為56 66°C，反應時間為40 70min。
所述滅活的溫度為8(TC，滅活時間為10min。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 (1)本發明根據靶基因序列設計了溶珊瑚弧菌檢測用引物組，能特異性識別靶 序列上的六個獨立區域，在BstDNA聚合酶的作用下啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA 區啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環 DNA混合物，由于LAMP技術只有在四條引物完全識別靶序列六個結合區的情況下才能 順利進行，所以本發明的引物組在很大程度上減少了擴增反應的背景影響，大大改善了 溶珊瑚弧菌檢測的特異性； (2)采用本發明的引物組對溶珊瑚弧菌進行檢測，因為特異性高，所以可以根據 是否擴增就能判斷目標基因的存在與否； (3)本發明的快速診斷試劑盒是利用環介導等溫擴增技術快速檢測溶珊瑚弧菌， 檢測靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少； (4)本發明的快速診斷試劑盒不但反應條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特 殊試劑，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點；
(5)本發明的快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到lh即可完成擴增，且產率 高； (6)本發明的快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶 液中的Mg+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液 后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠； (7)本發明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術素質要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實現現場高通量快速檢測； (8)本發明的快速診斷試劑盒建立了一套經過優化的反轉錄-環介導等溫擴增反 應(RT-LAMP)體系，不但使得溶珊瑚弧菌定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度 高，而且可用于魚、貝類養殖過程中各時期的溶珊瑚弧菌跟蹤檢測，避免該病原菌傳播 流行，提高科學管理效率，具有很高的實用價值。


圖1是LAMP檢測溶珊瑚弧菌靈敏度的試驗結果；其中M : Marker2000 : 1 : 660ng ; 2 : 66ng ; 3 : 6.6ng ; 4 : 660fg ; 6 :
66fg ; 7 : 6.6fg ; 8 :陰性對照； 圖2是LAMP檢測溶珊瑚弧菌特異性的試驗結果； 其中M: Marker2000 ; 1:菌株NA0301; 2:哈維氏弧菌；3:溶藻弧菌 (1.1883T) ; 4:溶藻弧菌V2; 5、黃桿菌Myroides odoratus ; 6:副溶血弧菌(1.1997);
7 :枯草芽孢桿菌；8 :大腸桿菌；9 :塔式弧菌；10、陰性對照。
具體實施例方式以下實施例僅用于闡述本發明，而本發明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施 例。所述技術領域的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取范圍，均可 實現本發明的目的。
實施例1 本實施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，該引物組由下述外引物
對和內引物對組成 其中外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC，VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC ; 內引物對為
G， 其中W二A和T; R二A和G。 實施例2 本實施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的試劑盒，所采用的引物組參見實 施例l，其含有以下可分離包裝的試劑 a)含有實施例l所述的引物組，該引物組中外引物對和內引物對的添加摩爾比為 1 : 1 10 ; 其中外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC, VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC; 內引物對為
VCFIP :
G， VCBIP :
其中W二A和T; R二A和G; b)陽性對照品含有溶珊瑚弧菌的基因組DNA，其濃度為5 20mg/mL ;
c)LAMP反應液含有IX反應緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 l.Omol/ L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04，所述的IX反應緩沖液含有20mM pH為8.8的 Tris-HCl、 10mmol/LKCl、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04和占反應緩沖液體積百 分含量為0.1% Triton X-100 ;
d)BstDNA聚合酶；e)顯色液含有常規熒光染料，該熒光染料可選擇SYBR Green I或EvaGreen ; 本發明的試劑盒里還可以包括一個泡沫板，該泡沫板的設計可以為其大小與
本發明試劑盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑小管數量的小孔，這樣 試劑盒中所用試劑分裝成的小管可以分別對應放置于這些小孔中，從而使得試劑都能處 于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用時殘留在管壁上的液體自動回到管底， 節約試劑。
上述試劑盒的生產工藝，包括如下步驟 (1)將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，分裝后 抽樣質檢； (2)將LAMP反應液無菌分裝，抽樣質檢； (3)將BstDNA聚合酶無菌分裝，抽樣質檢； (4)將顯色液無菌分裝，抽樣質檢； (5)將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢； (6)準備帶有小孔的泡沫板； (7)組裝試劑盒。 實施例3 本實施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚菌的方法，所采用的快速診斷試劑盒參 見實施例2。 該LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法為提取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反 應體系中加入上述引物組、LAMP反應液、BstDNA聚合酶，混勻，進行恒溫擴增反應， 8(TC滅活10min后，取滅活后部分液體產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產物加 入顯色液，觀察顯色結果，并同時對比陽性對照品的顯色結果，若顯示結果一致，則說 明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結果不一致，則說明待測樣品中不含有溶珊瑚弧 菌。 當該反應體系為每管25iiL時，每管反應體系中外引物對和內引物對的添加摩 爾比優選為l : 8， MgS04的濃度優選為1.2mmol/L，甜菜堿的濃度優選為1.0mmol/L， dNTPs的濃度優選為1.0mmol/L。 1X反應緩沖液包括20mM pH為8.8的Tris-HCl、 10mmol/L KC1、 10mmo1/ L(NH4)2S04、 2mmol/LMgS04和占反應緩沖液體積百分比為0.1% TritonX-lOO。
恒溫反應的溫度范圍為56 66t:，反應時間為40 70min ;優選的，溫度為 64.5 65°C，反應時間為70min。 其中滅活的溫度為8(TC，滅活時間為10min。 其中外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC， VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC ; 內引物對為
G， 其中W = A和T ; R = A和G ; 其中，待測樣品基因組DNA的提取過程如下 (1)取O.lg生物樣品，或lmL水樣離心濃縮，10,000rpm( 11,500Xg)離心 lmin，盡量吸凈上清；(2)向沉淀中加入200 ii L緩沖液GA，振蕩至其徹底懸浮； [cms](3)向管中加入20iiL蛋白酶K溶液，混勻； (4)加入220iiL緩沖液GB，振蕩15s， 7(TC放置10min，溶液應變清亮，短暫離 心以去除管蓋內壁的水珠； 加入緩沖液GB時可能會產生白色沉淀， 一般7(TC放置時會消失，不會影響后 續實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA量少和提取出的 DNA不純； (5)加220iiL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現絮狀沉淀，短暫離 心以除去管蓋內壁的水珠； (6)將步驟(5)所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管 中)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入500 ii L緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入700 ii L漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；
(9)向吸附柱CB3中加入500ii L漂洗液PW， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心30s， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(10)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm( 13,400Xg)離心2min，倒掉廢
液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液； 這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后
續的酶反應(酶切、PCR等)實驗； (11)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 ii L洗脫緩沖液TE，室溫放置2 5min， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心2min，將
溶液收集到離心管中。 為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心2min，洗脫緩沖液體積不應少于50 y L，體積 過小影響回收效率，洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應保證其 pH值在7.0 8.5范圍內(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH值低于7.0會降 低洗脫效率；且DNA產物應保存在-2(TC，以防DNA降解。 采用上述快速診斷試劑盒和方法進行LAMP檢測溶珊瑚弧菌靈敏度和特異性的 試驗結果如附圖l和2所示。 如圖1所示，靈敏度試驗結果表明LAMP擴增的特異性良好，無假陽性出 現；溶珊瑚弧菌的基因組DNA最低檢測限約為66fg;細菌純培養物檢測限為36cfu/ mL。 如圖2所示，特異性試驗結果表明僅溶珊瑚弧菌株NA0301出現了明顯的 LAMP擴增，其余菌株包括弧菌屬細菌和大腸桿菌等都未有階梯狀的擴增特征條帶，表 明特異性強。
序列表 <110>中國水產科學研究院南海水產研究所 <120> —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測方法 <140>200910192203.4 <141>2009-09-09 <160> <210>4 <211>19 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>1tggttgcaggtgacatcac 19 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>2tctactgggctgtacgtagc 20 <210>3 <211>45 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>3catwgcgatctcagcgttgtcttttgatcgctaacccagaacacg 45
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Vibirio.coralliilyticus
<400>4tggttacgttccagcttcagctttcaaccagtaggcgaccrat 4權利要求
一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，其特征在于，所述的引物組由下述外引物對和內引物對組成所述的外引物對為VCF3TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3TCTACTGGGCTGTACGTAGC所述的內引物對為VCFIPCATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACGVCBIPTGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT其中W＝A和T；R＝A和G。
2. —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，其特征在于，它含有權利要 求l所述的引物組、陽性對照品、LAMP反應液、BstDNA聚合酶和顯色液。
3. 根據權利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述引物組中外引物對和內 引物對的添加摩爾比為1 : 1 10。
4. 根據權利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應液含有1 X 反應緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 1.0mmol/L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04。
5. 根據權利要求4所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的1X反應緩沖液含有 20mmol/L pH為8.8的Tris-HCl、 10mmol/L KC1、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04 和占反應緩沖液體積百分比為0.1% Triton X-IOO。
6. 根據權利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的顯色液為含熒光染 料，所述的熒光染料為SYBR Green I或EvaGreen。
7. 根據權利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品為含有溶 珊瑚弧菌的基因組DNA。
8. —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法，其特征在于，采用權利要求2-7所述的試 劑盒，該方法包括以下步驟提取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反應體系中加入上述引物組、LAMP反應 液、BstDNA聚合酶，混勻，進行恒溫擴增反應后進行滅活，取滅活后部分產物進行瓊 脂糖凝膠電泳分析，剩余產物加入顯色液，觀察顯色結果，并同時對比陽性對照品的顯 色結果，若顯示結果一致，則說明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結果不一致，則 說明待測樣品中不含有溶珊瑚弧菌。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的恒溫反應的溫度范圍為56 66°C，反應時間為40 70min。
10. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述滅活的溫度為8(TC，滅活時間為 10min。
全文摘要
一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒和檢測方法，該引物組由下述外引物對和內引物對組成外引物對為VCF3TGGTTGCAGGTGACATCAC，VCB3TCTACTGGGCTGTACGTAGC；內引物對為VCFIPCATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG，VCBIPTGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT其中W＝A和T；R＝A和G。還公開了含有上述引物組的快速診斷試劑盒及檢測方法，該引物組、快速診斷試劑盒和檢測方法檢測時間短、特異性強，檢測靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK101691613SQ20091019220
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月9日 優先權日2009年9月9日
發明者劉廣鋒, 王江勇, 王瑞旋 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所