一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株、相關制劑及應用的制作方法

專利名稱：一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株、相關制劑及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及減毒突變株技術領域，特別涉及魚用細菌性減毒活疫苗技術領域，具 體是指一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株、相關制劑及應用。
背景技術：
隨著世界人口的不斷增長及人類對海產品需求的持續增強與天然漁業資源的日 益枯竭這對矛盾的日益突出，水產養殖作為一種傳統產業，在近代得到了快速，有效的發 展，并在社會、經濟和人們生活中突現出其重要地位。據統計，2002年我國水產品總量占全 球總產量的71%和總產值的49. 8%，居世界第一位。據農業部統計，2009年我國的水產品 總產量達5120萬噸，同比增長4. 5%左右，其中，養殖水產品產量3635萬噸。水產品總量連 續20年位居世界第一位，連續7年成為世界第一水產品出口國。但是，由于水土資源的有 限性，從提高養殖面積來增加產量難以實現持續發展。因此，規模化、集約化、高密度養殖模 式已成為我國魚類養殖業的主要發展方向。然而，伴隨著漁業養殖的穩步發展，隨之而來的 便是各種水產養殖病害問題。在我國，近幾年發展起來的海水網箱養殖和工廠化養殖魚類 的突發性、爆發性疾病頻繁發生。目前，我國的海水養殖平均死亡損失率在30%以上，每年 的經濟損失多達160億元，病害問題已成為制約海水養殖業健康發展的重要因素。為了防治各種病害的發生，以抗生素為代表的化學療法曾發揮了積極作用。但是， 由于盲目投藥，過量用藥，不但污染了水質，增強了病原體的抗藥性，提高了養殖成本，還直 接危害到人類健康。在歐盟、美國和加拿大，以抗生素為主的化學藥物在水產養殖業中已逐 漸被禁用。其中，根據歐盟食品安全白皮書的規定，歐盟國家禁止使用抗生素藥物的養殖水 產品進入貿易市場。日本也開始限制使用多種抗生素藥物用于養殖魚類和蝦類病害的防 治。2002-2006年，我國水產品及制品出口保持了年均14. 8%的增速。但是自2007年 以來，由于國內漁業生產成本上升、質量安全問題受到關注，以及日美歐等主要進口市場提 高了進口的技術門檻，導致我水產品出口頻頻受阻。2008年中國水產品出口量為296. 5萬 噸，同比下降3.2%，水產品出口量只占國內生產量6. 1%。一個主要的制約因素就是我國 的水產品質量安全問題突出，藥物和有害物殘留超標嚴重，對中國水產品質量信用造成嚴 重的負面影響，成為擴大出口的主要障礙。同時，由于病害嚴重，突發性強，為規避病害風 險，生產者普遍提早收獲，造成產品規格偏小，也影響了出口率和出口價格。為了增強水產 養殖業的國際市場競爭力，擴大水產養殖的出口創匯，國家已提出并開始推廣建立無公害 養殖技術規范，其中一個主要技術指標就是禁止使用抗生素藥物，以確保養殖水產品的食 品質量安全。為了實現海水養殖業的可持續發展，遏制各種環境因素和養殖密度激增等造成 的養殖魚類病害日益嚴重的發展趨勢，世界糧農組織結合發達國家漁業發展的成功經驗 (OrmondeP. Fisheries resources :trends in production, utilization and trade.In :Nomura I (ed.).The State ofWorId Fishery and Agriculture2002. Rome :FA0 Information Division, 2002, p3 p45), fi^ f= S it (System management
approaches, SMA)養殖模式預防各種病害的發生。這一措施中的一個主要內容就是提倡以 疫苗接種為代表的各種免疫防治技術的應用。這些措施的采用將大大減少化學藥物的使 用，既避免了對環境的污染，又增加了水產品的消費安全性。作為符合環境友好、可持續發 展戰略的經濟有效的疾病控制策略和手段，接種疫苗在現代水產養殖規范中正成為世界各 國研究和開發的主要前沿和應用領域。目前，接種疫苗因其安全性，可靠性和持久性，已成為世界范圍內防治水產養殖病 害發生及暴發的主要手段。疫苗具有針對性強、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治 主動的特點。以病原菌細胞滅活體為基礎形式的滅活疫苗(Kill vaccine)為水產養殖病 害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護 力)的技術應用缺陷，對于需要免疫成千上萬數量的魚類養殖業來說極為不便，給藥成本 往往不能被水產養殖業所承受。而且，對于病害發生嚴重的魚苗和幼魚則無法實施注射給 藥，同時，對許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無效。這一切都給水產養殖病害免疫防治技 術的廣泛應用帶來了阻礙。水產養殖業的產業特點要求病害防治技術必須經濟、應用實施方便。因此，疫苗產 品的開發除高效價的技術要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養殖業的承受能力。減毒活 疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發廣 譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護性)的新技術優勢，已成為當前國際上水產養殖用疫 苗研究和開發的熱點和前沿領域。弧菌是引起海水養殖魚類細菌性疾病危害的一種重要的病原體，可導致魚類弧菌 病(Vibriosis)，具有地域廣，周期長，發生溫度范圍大等特點，且危害種類多，包括鲆類， 鰈類，鱸科等多種海洋魚類。目前，我國海水養殖產業中危害比較嚴重的病原菌主要為溶 藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。其中溶藻弧菌是我國南方水產養殖魚類弧菌病爆發的主要病原體， 危害的魚類主要有石斑魚和大黃魚等；而鰻弧菌則為北方水產養殖魚類弧菌病的主要病原 體，危害的魚類包括牙鲆，大菱鲆，真鯛和鱸魚等名貴經濟魚種。目前弧菌病在我國尚無有 效的防治方法。溶藻弧菌廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數量位居海水類弧菌之首，也 是我國南方海水養殖中魚，蝦，貝類等海水養殖動物弧菌病暴發的主要病原菌，導致被感染 魚體表發白，感染部位，尾部及鰭末端充血，發炎，嚴重時感染部位潰爛，并能引起內臟器官 充血腫大，給水產養殖業帶來巨大的經濟損失。值得注意的是溶藻弧菌還會對人類帶來威 脅，可以引發創傷面感染，腹瀉以及中耳炎等。目前對于溶藻弧菌的致病機理研究尚處于探 索階段，已鑒定的毒力相關因子包括胞外蛋白酶類、脂多糖、鞭毛和鐵攝取相關系統等。目前國內用專利報道利用病原菌外膜蛋白及抗菌肽構建的亞單位疫苗對多種弧 菌具有防治作用(吳灶和，龐歡瑛，姚紹云，簡紀常，2007,海水魚致病弧菌外膜蛋白亞單位 疫苗的制備和使用方法；中國專利200610124342. X)。但由于亞單位疫苗不具有感染性，只 能采取注射給藥的方式進行免疫，而不能通過浸泡的方式給藥，操作不便。且由于其只具有 病原體的一種或幾種抗原，而不含有病原體的其他抗原和遺傳信息，僅利用單一的抗原分子誘導免疫反應，免疫效果不及活疫苗。此外，亞單位疫苗需要輔以佐劑，免疫劑量及成本 相對較高，效果較差。基因無標記缺失減毒疫苗構建技術是目前國際上新興起的活疫苗開發領域，是疫 苗開發的國際前沿領域與主要發展方向之一，所開發的疫苗家具有可靠的產品和環境安全 性。并且構建的減毒株具有表達異源抗原以開發多效價疫苗(特別是針對病毒病害)的潛 在價值，也成為疫苗開發的國際前沿和熱點領域。本發明涉及的溶藻弧菌野生毒株EPGS020401從我國福建省廈門養殖漁場內爆發 的弧菌病的病魚體內分離得到，是一種毒性的溶藻弧菌菌株，中國典型培養物保藏中心保 藏號為CCTCC No. AB209306。在利用Tn5轉座子構建含有約12000個突變株的溶藻弧菌突變 本(Qiyao Wang et al. Isolation, sequencing and characterization of cluster genes involved in thebiosynthesis and transportation of the siderophore of marine fish pathogen Vibrio alginolyticus. Arch Microbiol. 2007,188 :433_439),用 CAS平板檢測限鐵環境下鐵載體產量變化時篩選到一株鐵載體產量明顯下降的插入失活菌 株，經過測序及比對鑒定插入部位為sRNA分子伴侶蛋白Hfq，其編碼基因即hfq基因大小為 264bp。sRNA是一類長度在40-400個核苷酸，廣泛存在于從細菌到哺乳動物等不同生物體 內，執行多種生物學功能的非編碼RNA分子。同真核生物一樣，原核生物中的sRNA絕大多數 也是通過與靶標mRNA配對來影響其穩定性或翻譯，進而對細胞的各種生理功能進行調控。 Hfq蛋白作為sRNA的伴侶分子，通過改變sRNA分子和/或靶標mRNA分子的構象折疊而促 進兩者之間的配對。Hfq廣泛存在于真核生物和原核生物體內，具有較高的保守性，作為一 個轉錄后調控因子，協同sRNA分子通過堿基配對的方式與多種靶標mRNA進行結合，影響其 穩定性或翻譯，對于生物的多種生理功能具有重要的調控作用(FantappiiT L. et al. The RNA chaperone Hfq is involved in stress response andvirulence in Neisseria meningitidis and is a pleiotropic regulator of protein expression. Infectlmmun, 2009,77 1842-1853 ；Sittka et al. The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence ofSalmonella typhimurium. Mol Microbiol,2007,63 :193_217. 2007)。

發明內容
本發明的目的是克服了上述現有技術中的缺點，提供一種溶藻弧菌野生毒株的無 標記基因缺失減毒突變株、相關制劑及應用，該減毒突變株或相關制劑消除了傳統減毒活 疫苗普遍存在的潛在環境和產品安全風險，是針對養殖魚類的溶藻弧菌病的一種安全、有 效、經濟的疫苗。為了實現上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種溶藻弧菌野生毒株的無標 記基因缺失減毒突變株，其特點是，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻 弧菌毒株的sRNA分子伴侶蛋白基因hfq。因此，減毒突變株不攜帶任何抗生素抗性標記和 其它標記，無任何外源性基因片段。所述溶藻弧菌毒株可以是任何合適的溶藻弧菌毒株。較佳地，所述溶藻弧菌毒株 是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC No.AB209306。在本發明中，減毒疫苗株培養的培養基可選用LB培養基，其中的蛋白胨可以是酪 蛋白胨，胰蛋白胨或大豆蛋白胨，補加NaCl至3%，本發明的具體實施例選用了胰蛋白胨。
在本發明的第二方面，還提供了一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突 變株的制劑，其特點是，包括上述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株和在 藥理上可接受的配體。所述無標記基因缺失減毒突變株的菌體細胞濃度可以任意。較佳地，所述無標記 基因缺失減毒突變株的菌體細胞濃度為IO6 109CFU/ml。所述配體可以是任何合適的配套。較佳地，所述配體是無菌生理鹽水。其配方可 以是NaCl 9g/L, pH 為 7. 2。在本發明的第三方面，還提供了上述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒 突變株或上述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑在防治養殖魚類 的溶藻弧菌病中的應用。所述無標記基因缺失減毒突變株或所述制劑可以采用任何合適的方式及合適的 劑量給藥。較佳地，所述無標記基因缺失減毒突變株或所述制劑通過注射方式給藥，其中菌 體細胞濃度為IO4 106CFU/ml。本發明的有益效果在于1、本發明的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株缺失了 sRNA分子伴 侶蛋白基因hfq，相對于其野生毒株EPGS020401具有明顯的低毒性，可有效地保護魚類免 受溶藻弧菌病致病株溶藻弧菌的侵害，免疫效果顯著，具有非常好的水產養殖中溶藻弧菌 病的防治效果；2、本發明的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株不攜帶任何抗生素 抗性標記和其它標記，對環境不存在傳播抗生素抗性的潛在危險；無任何外源性基因片段， 毒力相關基因大片段缺失，毒力不可回復，極大消除向環境傳播大量毒性病原體的可能性， 具有技術上的環境和產品安全性，有實際的商業開發應用價值；3、本發明的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的突變的遺傳背景 清楚，減毒機理明確，易于區分疫苗株與野生株，便于對環境進行監控，提高疫苗的環境安 全性和可控性；4、本發明的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株為無標記基因缺失 減毒活疫苗的商業化進程提供了現實的開發和應用前景。


圖1是本發明采用Overlap PCR方法擴增獲得hfq基因缺失片段F1F2的流程圖。圖2是本發明利用圖1所示方法獲得的hfq基因缺失片段F1F2構建自殺質粒pDM4 并篩選獲得hfq基因缺失菌株流程圖。
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。實施例1無標記基因缺失減毒突變株的構建(一)hfq基因缺失菌株的構建1)PCR擴增獲得所需基因片段如圖1所示，以溶藻弧菌毒株EPGS020401 (保藏號為CCTCC No. AB209306)的基因組為模版，利用下列擴增引物Pl(TTAGTCGACCCGACAGATGTGGGAGTATTTAGAT)，P2 (TGTGGACGCTCGTCTTGTAGAGATTGCCCCTTAGCC)，P3 (CTCTACAAGACGAGCGTCCACAAGAGAAATCTGAAG)，P4 (GCTACTAGTGATATCGAGAATAAGACCAGTGCGG)，首先分別用Pl和P2、P3和P4擴增獲得Overlap PCR所需的上下片段F1，F2。回 收各片段后，利用Overlap PCR技術采用Pl和P4獲得hfq缺失片段F1F2。2)回收各片段從所要研究的對象上回收目標基因片段，采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒。瓊 脂糖凝膠電泳結束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝入Eppendorf管并 稱取重量，加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉離 心管，以確保膠塊充分溶解；將得到的溶液加入吸附柱中離心(12，OOOrpm離心30sec)， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μ1漂洗液PW， 12，OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，再用500 μ 1漂洗液PW12, OOOrpm離心30sec，倒掉廢液。 將離心吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm離心2min，盡量出去漂洗液，再將吸附柱置于室溫 或50°C溫箱數分鐘，徹底地晾干后，將其放到一個干凈地離心管中，向吸附膜中間位置懸空 滴加不少于30 μ 1的洗脫緩沖液EB buffer,室溫放置2min，12，OOOrpm離心Imin收集含目 的片段的DNA溶液，電泳檢測回收DNA濃度。3)構建自殺工具質粒將 pDM4 載 體(Wang et al. A ToxR homolog from Vibrio anguillarum serotype 01 regulatesits own production, bile resistance, and biofflm formation. J Bacteriol，2002，184 =1630-1639)多克隆位點的Sail位點和SpeI位點切開后，將目的 片段F1F2與切割后的質粒用T4 DNA連接酶16°C連接過夜。CaCl2轉化法轉化SM10，得到 質粒載體pDM4hfq。4)接合將攜帶有pDM4hfq質粒的SMlO按體積比3比1的比率與野生菌株EPGS020401混 合離心，去除上清液，用50微升新鮮含NaCl的LB培養基重懸沉淀。將0. 22微米滅菌 后的水性濾膜平整鋪放在新鮮半固體含1 % NaCl的LB培養基上，取出全部菌懸液點置于水 性膜中央。30攝氏度培養12小時后，用0. 2M的MgCl2將水性膜上的菌落洗脫下，涂布于氯 霉素，氨芐青霉素雙重抗性平板。5)正向篩選hfq基因插入失活克隆如圖2所示，自殺質粒pDM4hfq插入到基因組上hfq基因中。利用氯霉素，氨芐青 霉素雙重抗性平板篩選，及以P1/P4為引物的PCR擴增可獲得hfq基因插入失活的克隆。6)篩選hfq基因缺失菌株如圖2所示，在20%蔗糖LB半固體培養基平板上，利用pDM4上SacB基因可反向 篩選獲得發生第二次同源重組的菌株。以引物Pl，P4通過PCR驗證可獲得缺失突變菌株， 命名為hfq缺失突變株。( 二)減毒活疫苗制備培養基與生理鹽水組成
1)LB 斜面培養基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/ L，瓊脂 15g/L，ρΗ7· 5 ；2)種子培養基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L, NaCl 30g/ L,苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，對羥基苯甲酸20mg/L，對氨基苯甲酸 20mg/L, pH7.5 ；3)發酵培養基胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L, NaCl 30g/ L,苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，對羥基苯甲酸20mg/L，對氨基苯甲酸 20mg/L, pH6. 8 ；4)生理鹽水=NaCl 9g/L，ρΗ7· 2，121°C滅菌 20 分鐘。疫苗制備取一接種環保存于LB斜面培養基上的減毒疫苗株種子，接種于裝有 IOOml液體LB種子培養基的500ml搖瓶，在30°C下振蕩培養(轉速200轉/分鐘)。12小 時后，取5ml生長旺盛的菌液(0. D = 4. 0左右)接種于IOOml新鮮發酵培養基，30°C培養 9小時。用無菌生理鹽水洗滌3次，離心收獲菌體(2000 X g，15分鐘，15°C )，無菌生理鹽水 稀釋成一定濃度懸液(106-109CFU/ml)，保藏于15°C備用。實施例2 以斑馬魚(Danio rerio)為試驗動物的半致死量LD5tl測定試驗用魚先置于SPF(Specific Pathogen Free)實驗室適應養殖1周，以剔出不 正常個體。在感染試驗前，再將SPF試驗用魚放養于感染實驗室(Challenge Lab)中0. 5L 感染試驗水槽，繼續喂養1周，每槽放養10條(平均體長2. 5-3cm,體重0. 2g)。試驗水槽 每天使用無菌陳水替換1/2體積養殖水，水溫28°C，上下波動2°C。將試驗用魚隨機分組，每組2個水槽平行試驗。在感染試驗中，每組試驗魚用一定 梯度劑量(IO2-IO7CFU/尾)的溶藻弧菌野生毒株和減毒疫苗株通過尾部肌肉注射進行人 工感染。記錄10天內，每組每個感染劑量下每天的死亡尾數，并計算累計死亡率，測定LD5tl 值，取三組試驗的平均值(見表1)。表1 溶藻弧菌毒株EPGS020401和減毒株對斑馬魚的LD5tl
權利要求
一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株，其特征在于，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侶蛋白基因hfq。
2.根據權利要求1所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株，其特征在 于，所述溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC No.AB209306。
3.一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑，其特征在于，包括根 據權利要求1 2任一所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株和在藥理上 可接受的配體。
4.根據權利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑，其 特征在于，所述無標記基因缺失減毒突變株的菌體細胞濃度為IO6 109CFU/ml。
5.根據權利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑，其 特征在于，所述配體是無菌生理鹽水。
6.根據權利要求1 2任一所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株或 根據權利要求3所述的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑在防治養 殖魚類的溶藻弧菌病中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述無標記基因缺失減毒突變株或所述 制劑通過注射方式給藥，其中菌體細胞濃度為IO4 106CFU/ml。
全文摘要
本發明涉及一種溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株，它是溶藻弧菌毒株的減毒活疫苗，其中缺失了溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侶蛋白基因hfq，溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏號為CCTCC No.AB209306，還提供了上述溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株的制劑，及相關的在防治養殖魚類的溶藻弧菌病中應用，本發明的溶藻弧菌野生毒株的無標記基因缺失減毒突變株或相關制劑消除了傳統減毒活疫苗普遍存在的潛在環境和產品安全風險，是針對養殖魚類的溶藻弧菌病的一種安全、有效、經濟的疫苗。
文檔編號C12N1/20GK101948791SQ201010288980
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者劉歡, 劉琴, 張元興, 王啟要 申請人:華東理工大學