一種溶藻弧菌的檢測試劑盒的制作方法

一種溶藻弧菌的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)PCR檢測試劑盒，包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq?DNA聚合酶及引物，所述的引物堿基序列為SEQ?ID?No.1~2。本發明還提供含有所述引物的PCR檢測試劑盒。本發明所設計的引物檢測特異性好,靈敏度高,非常適用于檢測海產品中的溶藻弧菌。
【專利說明】一種溶藻弧菌的檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及海產品疾病檢測【技術領域】，具體涉及海產品致病微生物檢測方法，尤其是一種溶藻弧菌PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]我國海域遼闊，自然條件優越，海洋資源十分豐富。但目前開發利用的程度還很低。這也說明我國開發利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業資源寶庫，其盛產海參、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經濟發展。加強多邊和雙邊的海洋開發國際合作，集中集約開發利用海域及海島資源，合理配置優勢海洋產業，科學高效開發海洋資源，積極開展科研與試驗、開發與利用，海水養殖標準化是合理開發海水養殖資源的重要手段，研究制定海產品養殖標準，合理開發海水灘涂養殖資源，提高養殖海產品疾病是當今養殖業的重點內容。
[0003]海產品養殖是一項高風險的養殖業，傳統的小戶的海產品養殖給養殖戶帶來了巨大的市場和技術風險。為了將養殖戶養殖風險降到最低，開展對各類養殖業，包括魚、蝦、蟹、海參、鮑魚、貝類、海藻等各類海產品的疾病防治工作任務舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等有害細菌，是引起海產品各種疾病的罪魁禍首。
[0004]其中，殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonida、中間氣單胞菌Aeromonas media和海弧菌生物變種I Vibro pelagius biovar I均可引起刺參表皮潰爛病,癥狀為:發病初期，病參有搖頭現象，圍口腔膜松弛，觸手對外界刺激反應遲鈍，繼而出現排臟現象；發病中期，刺參口腹部出現小面積潰爛，形成小白斑，潰爛面積逐漸增大，口部腫大，不能收縮與閉合，逐漸失去攝食能力；發病末期，刺參體表大面積潰爛，身體收縮，溶解成粘膠狀。
[0005]假交替單胞菌Psevdoal`teromonas nigrifaciens可導致保苗期腐皮綜合征:病參首先口部腫大，觸手不能完全合攏；然后口部出現潰爛白斑，直至參體大面積潰爛，導致最終死亡。
[0006]燦爛弧菌Vibrio splendidus可導致耳狀幼體爛胃病、幼參急性口圍腫脹癥和養成期刺參腐皮綜合征等。發病癥狀:幼體:在顯微鏡下可見耳狀幼體胃壁增厚、萎縮、潰爛。幼參:活力下降，身體萎縮，口圍腫脹，排臟，體表潰爛，管足松弛失去附著力，脫落至池底，最后死亡。養成期:首先觸手過度伸張，逐步失去伸展活力，口部腫大，體表分泌粘液增多；然后，口部出現潰爛白斑，從小到大。嚴重者身體發生潰爛，最終導致死亡。
[0007]弧菌Vibro tapetis和病菌Marinomonas dokdonensis均可導致幼參急性口圍腫脹癥:病參活力下降，身體萎縮，口圍腫脹，排臟，體表潰爛，管足松弛失去附著力，脫落至池底，最后死亡。弧菌Vibrio Ientus還可導致耳狀幼體爛邊病:在顯微鏡下可見耳狀幼體邊緣突起處組織增生，顏色加深變黑，邊緣變得模糊不清，逐步潰爛，最后整個幼體解體消失。存活個體的發育遲緩、變態率低，即使幼體能變態附板I周左右也大多“化板”消失。
[0008]藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和燦爛弧菌(V.splendidus)是水產養殖業中常見的致病菌，對水生動物包括魚類、雙殼貝類、甲殼類和棘皮動物等的養殖造成了巨大的損失，溶藻弧菌對人的臨床感染也屢見報道，燦爛弧菌還可作為致病微生物之一；
[0009]世界海參養殖以刺參(溫帶種)和糙海參(熱帶種)為主要品種。除中國、日本、韓國主要養殖刺參外，其他國家均以糙海參為主要養殖對象。近年來，隨著自然資源的減少和消費需求的增加，海參的人工養殖在一些國家逐漸興起。其中，中國和日本是主要的養殖國家，印度、印度尼西亞、越南、菲律賓、韓國、埃及等也有小規模的增養殖。
[0010]刺參(Apostichopus japonicus)是我國有記載的20余種食用海參中價值最高、惟一分布于黃渤海域的溫帶種。其蛋白質含量高，糖類豐富，脂類含量低，且不含膽固醇，具有很高的營養保健和藥用價值，被人們視為重要的海珍品，因而具有重要的市場價值。近年來，海參消費需求量的逐年增加導致了世界范圍內海參自然資源的過度開發和種群數量的急劇下降，因此，海參的人工養殖也隨之發展起來。隨之而來的是海參養殖中遇到的各類問題。
[0011]其中，海參腐皮綜合癥，該癥也稱“皮膚潰爛病”，“化皮病”，是當前養殖刺參最常見的疾病，危害最為嚴重。越冬保苗期幼參和養成期海參均可被感染發病，但幼參的感染率、發病率和死亡率都高于成參，感染率很高，一旦發病很快就會蔓延至全池，死亡率可達九成以上，屬急性死亡。每年的1-3月份養殖水體溫度較低時(8°C以下)是發病高峰。感染初期病灶部位以假單胞菌屬的和燦爛弧菌為優勢菌，感染后期由于刺參表皮受細菌的侵襲腐蝕作用形成體表創傷面，易于使霉菌和寄生蟲富集和生長造成繼發性感染，加劇海參的死亡速度。
[0012] 溶藻弧菌病是指由各種類型溶藻弧菌所引起的對人類、以及海洋生物等不同形式的總稱。溶藻弧菌可引起刺參潰瘍病，發病癥狀為:患病刺參體表潰瘍，粘液增多，吐腸，1/4出現腫嘴，最后自溶死亡。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio),革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢、莢膜，單獨存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，適宜溫度為17~35°C。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作為一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于世界各地海水和海產品中，是許多海水養殖動物的致病菌。近年來在養殖生產上出現了較為嚴重的耐藥性現象，給養殖業帶來了很大的危害，這很可能與溶藻弧菌生物被膜的形成有關。溶藻弧菌還能引起人類食物中毒。溶血毒素、耐熱性腸毒素(ST)和不耐熱性腸毒素(LT)是致病性微生物中常見的致病因子。
[0013]因此，由溶藻弧菌引起的海洋生物疾病問題是常見的，而目前檢測溶藻弧菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。為了使得海產品因細菌引起的各種疾病有很好的預防和檢測，需要有新的方法能夠在一個短的時間內，在一個給定的樣品量中檢測病原體。

【發明內容】

[0014]本研究的目的是:建立一個新的檢測海產品中的病原體的方法。為達到直接在海產品中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)檢測的目的。本發明采用Primer Express 1.5軟件中設計的引物，提供一種溶藻弧菌PCR檢測試劑盒，其為:
[0015]上游引物:5，aggtctaaaagcagtcgc 3，, SEQ ID N0.1。[0016]下游引物:5，aacacttgttgtacgcac 3，SEQ ID N0.2。
[0017]其中，所述的引物擴增片段為499bp左右的片段，根據電泳結果，即可判斷為是否存在病原體基因。
[0018]本發明還提供含有上述引物的溶藻弧菌PCR檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq DNA聚合酶等。
[0019]本發明還提供應用上述的試劑盒在海產品中檢測溶藻弧菌的方法，其包括:
[0020]I)提取海產品中的DNA ；
[0021]2)以步驟I提取的DNA為模板進行PCR擴增；
[0022]3)對PCR產物進行電泳檢測。
[0023]其中，上文涉及到PCR擴增的步驟中，所述的PCR反應體系為:每20 μ I的反應液中，含有:(1)引物上、下游各 15mM, 100μ I ;⑵ 10XPCR 緩沖液，1.5ml ； (3) IOmM dNTPs,
1.5ml ； (5) 5U/ μ I Taq DNA 聚合酶，100 μ I ； (4)純化水，3.0ml。
[0024]其中，所述的PCR反應條件為:951:預變性11^11，951:變性308，601:退火508，72°C延伸lmin，共35個循環，最后72°C延伸IOmin0
[0025]取5~10 μ I PCR擴增產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為90V，電泳時間為40min，然后觀察PCR擴增產物有無499bp左右的特異性片段。
[0026]本發明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據現有技術確定，并通過配置或商業途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。
[0027]本發明公開了一種檢測海產品中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的引物和試劑盒。本發明的檢測試劑盒能準確靈敏地檢測海產品中的溶藻弧菌，DNA最低檢測濃度為5ng，而且與其他細菌無交叉反應，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統的檢測方法，而且本發明試劑保存時間長，無污染。本發明對解決大批量樣品的溶藻弧菌的現場檢測技術具有重要的現實意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為引物特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。I =DNAMarker ；2:溶藻弧菌；3:陰性對照；
[0029]圖2為細菌菌數系列稀釋的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。I =DNAMarker ；2:陰性對照，5ng梯度稀釋的樣品、IOng梯度稀釋的樣品、20ng梯度稀釋的樣品、40ng梯度稀釋的樣品、80ng梯度稀釋的樣品。
[0030]圖3為同時對溶藻弧菌菌株和對照菌株(大腸桿菌、霍亂弧菌)進行PCR檢測的電泳分析圖。1:DNA Marker ;2:溶藻弧菌菌株擴增的結果，3.陰性對照(水)4.霍亂弧菌菌株擴增的結果；5.大腸桿菌菌株擴增 的結果；
【具體實施方式】
[0031]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。[0032]實施例1
[0033](一)菌種篩選
[0034]取樣品野生刺參體表的剖刮樣品，研磨成糊狀后，于LB液體培養基中，于37°C培養24h。24h后在LB血瓊脂平板培養基上劃線接種。36.5°C培養24h后挑菌，3個黃色單菌落分別斜面接種，于35°C培養24h。分明經過革蘭氏染色檢驗，取呈陰性的菌種進一步進行鑒定。
[0035]檢測前，用標準計數法檢測，菌體為IO81g CFU/mL。
[0036](二)樣品處理
[0037]于無菌離心管中取菌體為IO81g CFU/mL的樣品用無菌生理鹽水沖洗三次；再于每個50mL離心管裝5ml樣品:10mL洗脫液I充分混合，4°C下1000rpm離心lOmin，保留下層清澈液，并1000Orpm離心lmin,收集沉淀待測；其中洗脫液1:磷酸二氫鉀:0.27g,磷酸氫二鈉:1.42g，氯化鈉:8g，氯化鉀:0.2g，加去離子水約700mL充分攪拌溶解，然后加入2%的CTAB溶液，用鹽酸調pH至7.4，定容到1L。
[0038]每Ig沉淀物中加IOOuL 20mg/mL溶菌酶和500uL裂解液，于37 V水浴酶解30mirT2h。其中，裂解液:3mL液體中含有體積比為2%的CTAB溶液，體積比為0.2%的β -巰基乙醇，加入 30uL 蛋白酶 K。其中，CTAB 溶液:100mmol/L Tris-Hcl，20mmol/L 的 EDTA，1.4mol/L 的 NaCl。
[0039]向獲得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脫液II，混勻后12000rpm離心IOmin ;其中，洗脫液I1:異戊醇:氯仿的體積比為1:24。
`[0040]吸取上清500uL加入洗脫液II 500uL,混勻后12000rpm離心IOmin ；
[0041]吸取上清400uL加入無水乙醇800uL，混勻后_20°C靜置20min，12000rpm離心IOmin ；
[0042]沉淀用體積比為70%的乙醇洗滌3次，晾干后溶于50uL超純水或30uL I X TE溶液中，-20°C條件下貯存。其中，其中，上文所述pH8.0的TE緩沖液組成:10mM Tris-HCl,ImM EDTA (乙二胺四乙酸)
[0043]配制500ml 的 ρΗ8.0 的 TE 緩沖液的方法:量取 5ml IM Tris-HCl PH=8.0 和 Iml
0.5MEDTA PH=8.0的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。
[0044](三)PCR擴增
[0045]取5 μ L上述方法提取的DNA，用作PCR的模板DNA。根據文獻中基因保守序列設計上下游引物，擴增片段大小為499bp，分別為:
[0046]上游引物:5，aggtctaaaagcagtcgc 3，, SEQ ID N0.1。
[0047]下游引物:5，aacacttgttgtacgcac 3，SEQ ID N0.2。
[0048]引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。使用德國EppendorfPCR擴增儀，擴增出細菌16S rDNA電泳圖，PCR擴增條件為:94°C變性5min ；94°C 30s, 55°C 30s，72°C lmin，30 個循環；72°C延伸 7min。
[0049]對以上鑒定出的細菌進行PCR，將PCR產物按PCR產物純化試劑盒說明書操作純化PCR產物，測序，基因序列用DNAStar軟件分析知，序列總長499bp，將所得序列Blast分析顯示，證實基因序列與溶藻弧菌(V.alginolyticus)的同源性最高，其與AY332570菌株的同源性達到99%。
[0050]實施例2
[0051]溶藻弧菌的PCR檢測試劑盒，包括:
[0052](I)弓丨物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0053]放入0.2ml的離心管中，把提取的菌體DNAl μ I加入上述體系中，總體積為20 μ 1，離心混勻后置PCR儀上進行擴增反應。
[0054]PCR 擴增條件為:94°C變性 5min ；94°C 30s，55。。30s, 72°C lmin, 30 個循環；72°C延伸7min。
[0055]取5 μ I PCR擴增產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為110V，電泳時間為35min，然后觀察PCR擴增產物有無預期的DNA特異性片段。結果表明，在499bp左右出現I條特異的條帶，而陰性對照則無條帶出現。
[0056]實驗例3
[0057]分別計算原料樣品，取摻入溶藻弧菌0.fl%的各類海產品(罐頭、干貨)，按照下述方法，提取樣品DNA:
[0058]米用Qiagen 公司的 DNA 提取試劑盒(Qiagen Blood & Cell Culture DNA MaxiKU，貨號13362)，并按其`操作說明提取基因組DNA。制備核酸標準樣品。
[0059](I)取細菌增菌培養液IOOmL,加到500mL無菌離心管中，4000g,4°C離心15min ；
[0060](2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8.0) 10mL，懸浮，加0.5mL 100g/L十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；
[0061](3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 1.5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
0.7mol/L NaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；
[0062](4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1)，混勻，6000g離心IOmin ；
[0063](5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24:I )，混勻，6000g 離心 IOmin ；
[0064](6)取上清，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，13000g離心IOmin ；
[0065](7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8.0)溶解，此即為細菌基因組核酸溶液。置于_20°C備用。
[0066]DNA經紫外分光光度計檢測并計算其濃度。將提取的DNA模板進行適度稀釋，用紫外分光光度計測定260nm波長下的OD值，DNA含量=OD260為50 μ g/ml (雙鏈DNA)，將其逐步稀釋，分別取I μ I為模板進行PCR反應，確定DNA最低檢測濃度為5ng，溶藻弧菌DNA樣品稀釋后含量為5ng、10ng、20ng、40ng、80ng幾個梯度的樣品進行以下實驗:
[0067]溶藻弧菌的PCR檢測試劑盒，包括:
[0068](I)引物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0069]放入0.2ml的離心管中，把提取的DNA I μ I加入上述體系中，總體積為20μ 1，離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應。[0070]反應條件為:95°C預變性lmin，95°C變性30s，60°C退火50s，72°C延伸lmin，共35個循環，最后72°C延伸IOmin。
[0071]取5 μ I PCR擴增產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為110V，電泳時間為35min，然后觀察PCR擴增產物有無預期的DNA特異性片段。結果如圖2，表明，樣品濃度在5ng以上的泳道中，都能在499bp左右出現I條特異的條帶,而陰性對照則無條帶出現。
[0072]實驗例4
[0073]以大腸桿菌、霍亂弧菌為對照菌，利用實施例1所述檢測方法同時對溶藻弧菌菌株和對照菌株進行PCR檢測，然后對PCR擴增產物進行電泳檢測，實驗結果見圖3。由圖可知，引物只對溶藻弧菌(泳道3)出現PCR陽性擴增反應，對照組(泳道4、5)未出現特異性片段，該引物顯示了良好的特異性。利用本發明所述的引物檢測樣品中的DNA，不但減少了引物用量，節約成本，而且縮短了檢測時間，提高檢測效率。
[0074]實施例5
[0075]菌種的生化鑒定
[0076]待測菌種經生理鹽水稀釋至約I X 109cfu/mL，用移液槍吸取0.05mL的菌液分別用070060弧菌科細菌生化鑒定盒進行鑒定，結果如表1，
[0077]表1.生化鑒定管結果
[0078]
【權利要求】
1.一種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) PCR檢測試劑盒,其特征在于:包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq DNA聚合酶及引物，所述的引物堿基序列為SEQ ID N0.1~2。
2.根據權利要求1所述的PCR檢測試劑盒，其特征在于，每20μ I的反應液中，含有:(I)引物上、下游各 15mM, 100μ I ; (2) 10XPCR 緩沖液，1.5ml ； (3) IOmM dNTPs, 1.5ml ；(5)5U/ μ ITaq DNA· 聚合酶，100 μ I ； (4)純化水，3.0ml。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820535SQ201210468704
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月16日 優先權日:2012年11月16日
【發明者】謝克煥 申請人:大連德通生物技術開發有限公司