一種通過菌藻共培養提高葉黃素產量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及葉黃素制備提取領域，具體設及一種通過菌藻共培養提高葉黃素產量 的方法。
【背景技術】
[0002] 葉黃素（lutein)，又名黃體素，是含氧類胡蘿h素--類葉黃素(xanthophyl)中的 一種，廣泛存在于花弁、水果蔬菜等植物中，作為一種天然黃色素，葉黃素可用作食品、醫藥 和化妝品的色素添加劑。此外，葉黃素能激發免疫反應，提高機體免疫力，防治年齡相關性 視黃斑退化引起的視力下降和失明等生理活性(吳正云，等，微藻生物合成葉黃素的研究進 展.食品科學，2010，31 (01): 268-273)。美國從20世紀70年代起開始從萬壽菊中提取葉黃 素，1995年美國食品藥品監督管理局(FDA)批準了葉黃素作為食品補充劑用于食品和飲料。 我國衛生部也于2007年批準葉黃素用于賠烤食品、飲料、果凍、果醬W及冷凍食品。目前具 有生物功能活性的葉黃素均來自植物。但植物種植占地面積大，成本高，周期長，受氣候條 件影響大，導致葉黃素的生產成本較高。
[0003] 小球藻是一種單細胞綠藻，其環境適應性強，易于大規模培養，細胞中含有豐富的 營養物質，特別是蛋白核小球藻具有長期安全食用的歷史，其中人工培養的蛋白核小球藻 已被批準作為新食品資源。小球藻尤W富含葉黃素（lutein)而受到關注(吳正云，等，小球 藻異養生長及葉黃素合成量影響因子的優化研究.上海交通大學學報(農業科學版），2007， 25(1):6-11)
[0004] 新興的菌藻共生技術有望突破當前小球藻開發方面存在的產率低、收獲難、成本 高等技術限制，大大拓寬小球藻的生產應用范圍。已有研究表明微藻和微生物之間存在從 寄生到共生等廣泛的互作現象，某些微生物能通過分泌生長激素和信號調節物質促進藻細 胞生長，提高藻細胞生物量和生化組分的積累[Ueda H,et al.Bacterial communities constructed in artificial consortia of bacteria and Chlorel la vulgaris .Microbes Environment，2010，25( I): 36-40 ?] D但不同種類的細菌對小球藻生長 和代謝的影響不同，有的促進，有的抑制，效果差別很大。通過篩選獲得優良菌株作為小球 藻的共生菌，人工構建菌藻共生體系一方面有望使藻細胞生長速率大幅提高(Park Y，et al.Growth promotion of Chlorella elIipsoidea by co-inoculation with Brevundimonas sp. isolated from the microalga.Hydrobiologia,2008,598(I):219-228；Kim B H，et al.民ole of rhizobium，a plant growth promoting bacterium,in enhancing algal biomass through mutualistic interaction.Biomass and Bioenergy ,2014,69(3) :95-105.),并可能通過利用共生菌分泌產生的生物絮凝劑的作用 提高藻細胞的絮凝率，大幅降低藻細胞的采收成本化ee J，et al .Microalgae-associated bacteria play a key role in the flocculation of Chlorella vulgaris.Bioresource Technology ,2013,131(2): 195-201;施春陽，等?微生物絮凝劑的 研究和應用進展[J].污染防治技術，2013,26(3) :48-51.)。
[0005] 植物內生菌是能夠定殖在健康植物內，并與宿主植物建立和諧共生關系的一類微 生物。水稻植株含有許多內生微生物，是重要的內生細菌資源，來源于水稻植株的內生泛菌 可W顯著促進宿主水稻的生長，提高其生物量、葉綠素及憐含量的生物學作用（Fen巧，et al.民ice endophyte Pantoea aggIomeransYSI9promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates.Journal of Applied Microbiology, 2006，100(5): 938-945.劉佳，等.內生成團泛菌HAUMl對宿主水稻的定殖及促生作用.湖北 農業科學，2011，50(23): 4820-4824.)。由于小球藻與植物細胞一樣具有葉綠體，能夠進行 光合作用，其生化代謝特征與植物具有相似性，理論上，對植物具有代謝調節作用的植物內 生菌也能影響小球藻的生長和代謝活動，但迄今國內外未見采用包括水稻內生菌在內的植 物內生菌促進小球藻生長及生化組分合成積累的技術研究和應用。
[0006] 已有研究表明，通氣量和葡萄糖濃度等對小球藻比生長速率和細胞的葉黃素含量 的影響趨勢大體相同，即有利于提高小球藻比生長速率的條件也同時有利于增加細胞的葉 黃素含量，運可能是由于葉黃素為初級類胡蘿h素，其合成在很大程度上與細胞生長相關 (Zhang D H,et al.Composition and accumulation of secondary carotenoids in Qilorococcum sp.[J]. J Appl Phycol, 1997,9(2) :147-155;吳正云，等，小球藻異養生長 及葉黃素合成量影響因子的優化研究.上海交通大學學報(農業科學版），2007,25(1) :6- 11)。
[0007] 本發明針對當前小球藻工業化生產中藻細胞生產效率低，葉黃素制備成本較高的 關鍵技術限制，開發一種應用水稻內生泛菌促進小球藻生長速率和提高葉黃素產量的人工 菌藻共培養技術。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種通過菌藻共培養提高葉黃素產量的方法，通過應用水稻內生泛 菌和小球藻進行菌藻共培養提高小球藻細胞的生長速率和生物量，同時提高藻細胞的葉黃 素含量。
[0009] -種通過菌藻共培養提高葉黃素產量的方法，包括W下步驟：
[0010] 1)將第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻在光照下進行第一輪菌藻共培養，培養 結束后，得到第一輪菌藻共培養液；
[0011] 2)在第一輪菌藻共培養液中再補加第二次加入的水稻內生泛菌，在光照下進行第 二輪菌藻共培養，培養結束后，得到第二輪菌藻共培養液；
[0012] 3)對第二輪菌藻共培養液經離屯、后得到菌藻細胞沉淀，之后經后處理得到菌藻細 胞干品；
[0013] 4)將小球藻細胞干品粉碎，得到菌藻粉，之后采用有機溶劑提取液提取葉黃素，得 到葉黃素。
[0014] W下作為本發明的優選技術方案：
[0015] 步驟1)中，所述的第一輪菌藻共培養的條件為:培養條件均為23°C~33°C，光強 1500~2500LUX，光周期為10~14虹晝/10~Hhr夜，主要為靜置培養，每天搖動培養瓶混勻 2~6次直至培養周期結束，培養周期為6~12天。進一步優選，所述的第一輪菌藻共培養的 條件為:培養條件均為28°C，光強2000LUX，光周期為12hr晝/1化r夜，主要為靜置培養，每天 搖動培養瓶混勻4次直至培養周期結束，培養周期為8天。
[0016] 所述的第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻的菌藻比為1~10000:1，在一定范圍 內，水稻內生泛菌的比例越高，越能夠促進小球藻的生長，越能夠提高藻細胞的葉黃素含 量。進一步優選，所述的第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻的菌藻比為10~1000:1。再進 一步優選，所述的第一次加入的水稻內生泛菌和小球藻的菌藻比為100~1000:1。
[0017] 所述的水稻內生泛菌可采用市