廣譜復合微生物殺菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種廣譜復合微生物殺菌劑及其制備方法，它由以下3種微生物組成原復合孢子粉：蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）GSICC32807、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens?）GSICC32826和寡雄腐霉（Pythiumoligandrum）GSICC61615。將兩種細菌孢子粉和一種真菌孢子粉按照1:1:1的重量比混合，從而制成廣譜復合微生物殺菌劑產品。本發明提供的廣譜復合微生物殺菌劑產品能迅速定植到植物根圍，通過與病原菌競爭侵染位點、重寄生作用、分泌生長素和促進植物營養吸收等作用，顯著預防、拮抗并殺滅多種作物微生物病害；同時具有促進生作物長、提高產量和改善品質的功效。
【專利說明】廣譜復合微生物殺菌劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物農藥【技術領域】，涉及一種廣譜復合微生物殺菌劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]全球由于農作物病蟲害導致的經濟損失巨大，化學農藥對病蟲害的防治和農業生產的發展起到了巨大的推動作用，但是人類對其不加節制的濫用，造成環境污染不斷加重，人畜中毒頻繁發生，也使害蟲抗藥性增強。因此，開發使用高效、廣譜的環保型生物農藥，對于農業的可持續發展、保障人類健康和食品安全、維護生態環境和生物多樣性都具有重要意義。國家中長期科技發展綱要中，“環保型農藥創制和生態農業”被列為農業發展重點領域，“開發環保型農藥創制關鍵技術”是其優先主題，也是國家十二五科技發展規劃中現代農業技術研究中的前沿技術。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種廣譜復合微生物殺菌劑，以解決現有殺菌劑使環境污染不斷加重、人畜中毒頻繁發生，使害蟲抗藥性增強的問題。
[0004]本發明的另一個目的是提供該復合微生物殺菌劑的制備方法。
[0005]本發明技術方案如下:
一種廣譜復合微生物殺菌劑，它由以下3種微生物組成原復合孢子粉:蘇云金芽抱桿菌{Bacillus thuringi ensi s ) GSICC 32807、解淀粉芽抱桿菌{Bacillusamyloli quefaci ens ) GSICC 32826 和寡雄腐霉應)GSICC 61615。
[0006]這3株菌種均從甘肅省工業微生物菌種保藏中心(GSMSC)夠得。
[0007]為了更好地實現本發明，廣譜復合微生物殺菌劑還含有以下成分，營養物、潤濕劑、分散劑、載體材料，各物質的重量配比為:
原復合孢子粉3%、5%-10%的營養物、5%的潤濕劑、15%的分散劑、67%-72%的載體材料，其中營養物為硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑的混合物，潤濕劑為十二烷基硫酸鈉，分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉的混合物，載體材料為高嶺土、硅藻土或膨潤土。所述硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑的質量比為5.415:2.32:10，所述木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉的質量比為1:1。
[0008]一種廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于它由下列步驟組成:
O菌種活化
由于菌種長時間保藏于4°C菌種庫中，因此在使用前要進行復活。取權利要求1中3株菌種進行斜面培養，在室溫放置1-2天后，分別轉接到試管進行斜面培養，在25-28°C溫度下菌種復活培養基中培養3天，得到活化菌種；
2)兩種細菌孢子粉的制備`
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌株分別接種到一級液體種子培養基中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；再轉接到細菌發酵罐培養基中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到生產罐中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養，發酵2-3天，得到液體細菌懸浮液；兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，含有效活菌數> 100億個/克；
3)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，接種到一級液體種子培養基中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天；然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天，再轉接到細菌發酵罐培養基中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天；將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵3-5天，形成大量孢子，將產生孢子的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數≥ IX IO9 個/g;
4)復合微生物殺菌劑產品制備
將步驟2和3得到的三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后，為原復合孢子粉；按照以下比例制成復合微生物殺菌劑產品，原復合孢子粉3%，配合5%-10%的營養物，5%的潤濕劑，15%的分散劑，65%-75%的載體材料。
[0009]該復合微生物殺菌劑產品中:蘇云金芽孢桿菌有效活菌數> IX IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數> IXIO9個/g，寡雄腐霉孢子數> I X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0010]為了更好地實現本發明，步驟2和步驟3中蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌及寡雄腐霉斜面培養菌株的接種量為5%-10%。步驟2中蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌株的發酵時間為2天。
[0011]為了更好地實現本發明，步驟I中菌種復活培養基配方:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%，具體制作:取一定量的馬鈴薯，去皮、切成塊煮沸30min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補足水，補足水，待瓊脂溶化后分裝試管，121°C滅菌30min。
[0012]為了更好地實現本發明，步驟2中液體種子培養基配方:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，具體制作:取200g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸30min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補足水，121°C滅菌30min。
[0013]為了更好地實現本發明，步驟2和3中的細菌發酵罐培養基組成及質量含量為:糖蜜3-5%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀0.05%,硝酸鉀
0.1%，加水補足，pH值為6.8-7.4。
[0014]為了更好地實現本發明，步驟2中固體發酵培養基配方:豆餅5%，玉米粉10%，麩皮50%，秸桿粉35%，其中固體物料與水分的質量比為3:2。
[0015]本發明菌劑的使用方法可溝施、穴施、毒土、浸種、蘸根、噴施、灌根。
[0016]本發明菌劑的機理如下:
蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringi ens is、簡稱Bt,是目前產量最大、使用最廣泛的鱗翅目蟲害生物防治劑。 但Bt的防治效果受環境影響較大，速效性差、易產生抗性、生態位小等缺點，影響Bt產品規模化推廣應用。解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloli quefaci ens)是一株與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，對真菌引起的稻瘟病、紋枯病、枯萎病和灰霉病等病害均有防治效果。但由于解淀粉芽孢桿菌在土壤中受溫度和濕度影響較大，且生態位小，因此對作物真菌病害的防治效果有限，制約該菌株的生產應用。[0017]寡雄腐霉是腐霉屬的一個種，目前已鑒定腐霉屬有200多種，大多數都是植物的致病菌，但是寡雄腐霉卻是很多植物的生防菌。因為寡雄腐霉屬于腐霉屬，所以對很多植物有廣譜的寄生性，寄生后能明顯提高植物的抗病性。研究表明，寡雄腐霉對西紅柿、土豆、水稻、黃瓜和葡萄等植物的細菌和真菌病害防治發揮很好的作用。寡雄腐霉細胞壁蛋白擬隱地蛋白(CWPs)可作用于LeATL6泛素蛋白連接酶E3誘導防御反應。還有研究發現寡雄腐霉在防治西紅柿細菌性枯萎病時，對墨綠酸信號具有依賴性。可見寡雄腐霉通過增強植物自身的防御系統來實現生防作用，因此對植物的產品和質量具有安全性，而且寡雄腐霉為真菌生物防治劑，容易培養、繁殖快、生態位大，適合生物防治劑的開發。
[0018]作物的病蟲害多數是有害蟲咬噬后，為病原菌提供入侵機會而引起的綜合病害。本發明根據其致病性特點，利用蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和寡雄腐霉協同性的效果，有針對性的開發具有殺蟲和防治微生物病害的廣譜復合微生物殺菌劑產品，使本發明產品解決現有殺菌劑使環境污染不斷加重、人畜中毒頻繁發生，使害蟲抗藥性增強的問題。本發明提供的廣譜復合微生物殺菌劑產品能迅速定植到植物根圍，通過與病原菌競爭侵染位點、重寄生作用、分泌生長素和促進植物營養吸收等作用，顯著預防、拮抗并殺滅多種作物微生物病害；同時具有促進生作物長、提高產量和改善品質的功效。
[0019]本發明所選用的微生物菌種均是農業部授權的植物有益微生物，經復配制成廣譜復合微生物殺菌劑產品，具有以下優點:
1、本發明的微生物種類搭配合理，蘇云金芽孢桿菌能防止鱗翅目蟲害，減少害蟲咬噬為病原菌入侵提供的“便利通道”;解淀粉芽孢桿菌分泌耐高溫抗菌物質、蛋白酶和生長素等，對病害防治發揮一定的生防促生作用，但其生態位小、易受環境因素影響；而寡雄腐霉對解淀粉芽孢桿菌的功能進一步補充，其生態位大，容易繁殖，寄主廣泛。三者結合對病蟲害防治具有高效、廣譜的作用。
[0020]2、本發明的廣譜微生物殺菌劑在營養物質和載體材料選擇上，充分考慮到細菌和真菌對營養物質的需求以及微生物之間的拮抗、協同效應。本發明復合微生物菌劑制備方法簡便可行，有效孢子數含量高，微生物存活時間長，產品穩定。
[0021]3、本發明產品使用簡便，不但能防止蟲害、細菌和真菌引起的病害，而且還能促進作物生長、提高作物產量和品質，是現代有機農業的綠色伴侶。
【具體實施方式】
[0022]首先從甘肅省工業微生物菌種保藏中心(GSMSC)獲取上述3支菌種的斜面培養。由于菌種長時間保藏于4°C菌種庫中，因此在使用前要進行復活。具體復活方法:從保藏中心取到以上菌種，在室溫放置1-2天后，分別轉接到試管斜面培養，25-28°C培養3天，就得到活化菌種。
[0023]IL菌種復活培養基配方:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g。具體制作:取200g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸30min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料，待瓊脂溶化后補足水至1L，分裝試管，121°C滅菌30min。
[0024]實施例1
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照5%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵3天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數100億個/克；解淀粉芽孢桿菌含有效活菌數108億個/克。
[0025]2)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照5%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵3天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為1.5X109個/g°
[0026]3)復合微生物殺菌劑產品制備
三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物5%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料72%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.2 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.2 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數
5.6 X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0027]實施例2
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中 ，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵3天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數110億個/克；解淀粉芽孢桿菌含有效活菌數112億個/克。
[0028]2)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵3天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為2.0 X IO9個/g°
[0029]3)復合微生物殺菌劑產品制備
三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物10%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料67%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.8 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.5 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數6 X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0030]實施例3
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照10%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵3天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數113億個/克；解淀粉芽孢桿菌含有效活菌數115億個/克。
[0031]2)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照10%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵3天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為
2.2X109 個/g。
[0032]3)復合微生物殺菌劑產品制備
三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物8%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料69%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.52 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.38 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數6X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0033]實驗結果表明:營養物的添加比例對復合微生物菌劑有效微生物數量有影響，營養物比例越高，有效微生物數量有所增加，表明營養比例含量高，營養豐富時微生物有輕微增殖情況。在本實驗范圍內，復合微生物殺菌劑產品含有蘇云金芽孢桿菌有效活菌數> I X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數> I X IO9個/g ;寡雄腐霉孢子數> I X IO7個/go該復合微生物殺菌劑產品指標滿足殺菌劑產品要求。
[0034]實施例4
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵I天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數80億個/克；解淀粉芽孢桿菌含有效活菌數96億個/克。
[0035]2)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照5%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵3天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵5天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為6.4X IO9個/g°
[0036]3)復合微生物殺菌劑產品制備
三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物5%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料72%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.2 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.2 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數
5.6 X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0037]實施例5
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數130億個/克；解`淀粉芽孢桿菌含有效活菌數124億個/克。
[0038]2)真菌孢子粉的制備將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵3天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵5天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為6.8 X IO9個/g°
[0039]3)復合微生物殺菌劑產品制備 三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物10%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料67%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.8 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.5 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數
6X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0040]實施例6
I)兩種細菌孢子粉的制備
將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種斜面培養菌株，按照8%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C、轉速180轉/分的搖床上培養，發酵2天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵2天。將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到500L生產罐中，溫度28-30°C，轉速180轉/分，發酵3天，可以得到液體細菌懸浮液。兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，蘇云金芽孢桿菌含有效活菌數108億個/克；解淀粉芽孢桿菌含有效活菌數112億個/克。
[0041]實驗結果表明:接種量對兩種孢子粉有效菌數的影響不大，發酵罐發酵時間對孢子粉有效菌數影響較大，第二天時有效活菌數最多，隨著發酵時間的延長，由于細菌自溶使得有效活菌數稍微下降。因此，兩種細菌孢子粉的最佳制備工藝為接種量5%_10%，發酵時間均2天最佳。
[0042]2)真菌孢子粉的制備
將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，按照10%的接種量分別接種到500mL —級液體種子培養基中，25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C、轉速200轉/分的搖床上培養，發酵3天。再轉接到50L細菌發酵罐培養基中，溫度25-28°C，轉速200轉/分，發酵3天。將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵5天即可形成大量孢子。將產孢的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液進一步濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數為
6.5 X IO9 個/g。
[0043]實驗結果表明:接種量對寡雄腐霉孢子數的影響不大，固體發酵培養時間對孢子數影響較大，第5天孢子數明顯高于第3天，表明菌絲老化、培養基中營養物降低有利于孢子形成。因此，寡雄腐霉孢子粉的最佳制備工藝為接種量5%-10%，固體發酵培養時間5天最佳。
[0044]3)復合微生物殺菌劑產品制備
三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后為原復合孢子粉。復合微生物殺菌劑產品中含有原復合孢子粉3%，營養物8%，5%的潤濕劑，15%的分散劑，載體材料69%。其中營養物是硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑按照5.415:2.32:10的質量比例混合而成；潤濕劑為十二烷基硫酸鈉；分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉1:1的質量比混合物；載體材料主要是高嶺土、硅藻土或膨潤土。按照其比例復配即可得到蘇云金芽孢桿菌有效活菌數1.52 X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數1.38 X IO9個/g，寡雄腐霉孢子數6X IO7個/g的廣譜復合微生物殺菌劑。
[0045]實驗結果表明:營養物的添加比例對復合微生物菌劑有效微生物數量有影響，營養物比例越高，有效微生物數量有所增加，表明營養比例含量高，營養豐富時微生物有輕微增殖情況。在本實驗范圍內，復合微生物殺菌劑產品含有蘇云金芽孢桿菌有效活菌數> I X IO9個/g，解淀粉芽孢桿菌有效活菌數> I X IO9個/g ;寡雄腐霉孢子數> I X IO7個/go該復合微生物殺菌劑產品指標滿足殺菌劑產品要求。
[0046]實用例1:復合微 生物殺菌劑對小麥病害防治和增產的應用效果
盆栽實驗:從小麥根部分離一株病原菌，經鑒定為強雄腐霉iPythiumarrhenomanes)。對照(CK):無菌土壤基質；實驗組1(P.A):添加5%。的強雄腐霉致病菌的滅菌土基質；實驗組2 (P.0):添加5%。的復合微生物菌劑產品的滅菌土基質；實驗組3 (P.0+P.A):共同添加
2.5%。的強雄腐霉致病菌和2.5%。的復合微生物菌劑產品的滅菌土基質。每個實驗處理9個重復，分別燒IL水后,種春小麥L8275,溫室培養。結果如表1:復合微生物菌劑產品的防病和促生效果。
表1:復合微生物菌削產品的防病促生效巢
【權利要求】
1.一種廣譜復合微生物殺菌劑，其特征在于:它由以下3種微生物組成原復合孢子粉:蘇云金芽抱桿菌thuringiensi5) GSICC 32807、解淀粉芽抱桿菌amyloliquefaciens ) GSICC 32826 和寡雄腐霉應)GSICC 61615。
2.根據權利要求1所述的廣譜復合微生物殺菌劑，其特征在于:它還含有以下成分，營養物、潤濕劑、分散劑、載體材料，各物質的重量配比為: 原復合孢子粉3%、5%-10%的營養物、5%的潤濕劑、15%的分散劑、67%-72%的載體材料，其中營養物為硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑的混合物，潤濕劑為十二烷基硫酸鈉，分散劑為木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉的混合物，載體材料為高嶺土、硅藻土或膨潤土。
3.根據權利要求2所述的廣譜復合微生物殺菌劑，其特征在于:所述硝酸銨、磷酸二氫鉀和腐植酸鉀微量元素螯合劑的質量比為5.415:2.32:10，所述木質素磺酸鈣和亞甲基雙萘磺酸鈉的質量比為1:1。
4.權利要求1所述廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于它由下列步驟組成: O菌種活化 取權利要求1中3株菌種進行斜面培養，在室溫放置1-2天后，分別轉接到試管進行斜面培養，在25-28°C溫度下菌種復活培養基中培養3天,得到活化菌種； 2)兩種細菌孢子粉的制備 將活化好的蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌株分別接種到一級液體種子培養基中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；然后轉接到二級種子搖瓶中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；再轉接到細菌發酵罐培養基中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養；將細菌發酵罐培養基的菌種輸送到生產罐中，在28-30°C溫度、轉速為180轉/分的搖床上培養，發酵2-3天，得到液體細菌懸浮液；兩種細菌懸浮液經過濃縮低溫干燥后，制備成孢子粉，含有效活菌數> 100億個/克； 3)真菌孢子粉的制備 將活化好的寡雄腐霉斜面培養菌株，接種到一級液體種子培養基中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天；然后轉接到二級種子搖瓶中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天，再轉接到細菌發酵罐培養基中，在25-28°C溫度、轉速為200轉/分的搖床上培養，發酵2-3天；將細菌發酵罐培養基的菌種接種到固體發酵培養基中，發酵3-5天，形成大量孢子，將產生孢子的固體發酵培養基浸潤在無菌水中，制備孢子懸液，然后將真菌孢子懸液濃縮、低溫干燥，制成真菌孢子粉，孢子數≥ IX IO9 個/g; 4)復合微生物殺菌劑產品制備 將步驟2和3得到的三種孢子粉按1:1:1的比例混合均勻后，為原復合孢子粉；按照以下比例制成復合微生物殺菌劑產品，原復合孢子粉3%，配合5%-10%的營養物，5%的潤濕劑，15%的分散劑，65%-75%的載體材料。
5.根據權利要求4所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟2和步驟3中蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌及寡雄腐霉斜面培養菌株的接種量為5%-10%。
6.根據權利要求5所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟2中蘇云金芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌株的發酵時間為2天。
7.根據權利要求6所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟I中菌種復活培養基配方:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%，具體制作:取一定量的馬鈴薯，去皮、切成塊煮沸30min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補足水，補足水，待瓊脂溶化后分裝試管，121°C滅菌30min。
8.根據權利要求7所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟2中液體種子培養基配方:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，具體制作:取200g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸30min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補足水，121°C滅菌30min。
9.根據權利要求8所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟2和3中的細菌發酵罐培養基組成及質量含量為:糖蜜3-5%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，硝酸鉀0.1%，加水補足，pH值為6.8-7.4。
10.根據權利要求9所述的廣譜復合微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于:步驟2中固體發酵培養基配方:豆餅5%，玉米粉10%，麩皮50%，秸桿粉35%，其中固體物料與水分的質量比為3:2。
【文檔編號】A01P1/00GK103651582SQ201310423718
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】周劍平, 祝英 申請人:周劍平, 祝英