一種生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及了利用固態發酵技術生產富含苯乳酸的凝結芽孢桿菌固態發酵飼料。利用凝結芽孢桿菌進行固態發酵，對發酵過程的控制，及發酵后期苯乳酸提取、檢測條件的探索，來確定樣品中苯乳酸的產量。最終，通過培養基優化和底物的添加，獲取苯乳酸最高產量的凝結芽孢桿菌固態發酵飼料。該飼料有效的提高了產蛋雞的產蛋率，降低死淘率和料蛋比，最佳使用濃度為0.15%。苯乳酸是一種新型抑菌物質，具有增強動物免疫力，提高畜禽肉質，降低家畜體內大腸桿菌數量等功能。固態發酵中苯乳酸的產生，使凝結芽孢桿菌更好的發揮益生功能，從而進一步提高了這種固態發酵飼料的利用價值，富含苯乳酸的凝結芽孢桿菌固態發酵飼料在畜禽養殖業中具有更高的應用價值。
【專利說明】一種生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料及其制備
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制劑領域，是一種利用固態發酵凝結芽孢桿菌提高苯乳酸的產量，從而獲取富含苯乳酸的固態發酵飼料，獲取具有更高應用價值的固態制劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]微生態制劑又稱活菌制劑或生菌劑，主要是用于調節動物機體微生態平衡，具有直接通過增強動物對腸內有害微生物的抑制作用或通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，從而促進動物生長或提高飼料轉化率的一類藥物或飼料添加劑。微生態制劑具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留、成本低、效果顯著、不污染環境等特點，可以促進動物胃腸道正常微生物區系的建立，阻礙有害物質及廢物的吸收，改善畜產品的質量等，克服了抗生素所產生的菌群失調、二重感染和耐藥性等缺點，具有顯著的經濟效益和社會效益。
[0003]凝結芽孢桿菌是被美國，歐盟，日本批準做為飼料添加劑使用的微生物。它具有調節腸道功能紊亂，增加動物消化功能，維持腸道內菌群平衡和提高機體健康水平以及生產性能，提聞動物免疫力等功能。另外，芽抱的廣生還使凝結芽抱桿菌具有耐酸喊，耐聞溫抗逆性強這些優點，從而凝結芽孢桿菌能很好的適應培養環境，容易培養。
[0004]凝結芽孢桿菌主要以兩種方式來影響機體的消化作用:一是促進產生多種消化酶的分泌，提高對營養物質的消化與吸收；二是通過該菌種在動物消化道內生長、繁殖和定植，直接產生如維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等多種營養物質，并明顯增加小腸蠕動的速度，改善腸道消化功能，促進對飼料中各種營養成分的消化與吸收。
[0005]苯乳酸最早發現存在蜂蜜里面，最近發現一些微生物例如大部分的乳酸菌，芽孢桿菌屬等也能產生苯乳酸。作為一種防腐劑，苯乳酸具有廣譜抑菌活性:能夠抑制許多細菌例如李斯特菌屬，葡萄球菌，大腸桿菌，沙門氏菌和許多真菌包括酵母，許多的霉菌(婁地青霉，桔青霉)；苯乳酸已經用在了飼料中，它對母雞的免疫系統產生一些積極的影響，最終有效提高產蛋量和蛋的質量。苯乳酸添加在雞的飼料中時，能夠提高產量，在腸道內產生抗病原體的活性，降低肉質發黃；苯乳酸在剛斷奶的和增長的豬體內能夠提高與免疫有關的血細胞的數量，降低大腸桿菌的數量。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種固態發酵凝結芽孢桿菌提高苯乳酸產量，從而獲取富含苯乳酸的固態發酵飼料的一種方法。
[0007]本發明實現目的的技術方案如下:
[0008]凝結芽孢桿菌液體種子接入固態培養基中進行固態發酵培養，固態培養基的基本成分為豆柏，米糠，麥芽浸粉和水分組成，所述固態培養基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，來提高苯乳酸的產量；固態發酵55-65h，發酵溫度為33-38°C，發酵室內的相對濕度控制在75-80%，發酵期間每隔12h翻勻一次。固態發酵培養后獲得固態發酵飼料。
[0009]固態培養基組分為水分，豆柏，米糠，麥芽浸粉；所述固態培養基中各組分的的添加量如下:水分，豆柏，米糠，麥芽浸粉分別為500-700g/kg，200-250g/kg，50_100g/kg, 20-50g/kg。
[0010]固態發酵培養基接種量范圍為5-15%，接種量為10%時苯乳酸產量最大。苯丙酮酸的添加濃度為2-3g/kg ;苯丙氨酸的添加量為2.5-3.5g/kg時；
[0011]苯丙酮酸的最適添加濃度為2.7g/kg,苯乳酸產量最大為815mg/kg,此時的轉化率為98.7% ；
[0012]苯丙氨酸的添加量為3g/kg時，苯乳酸產量為752mg/kg，此時轉化率為94.9%。
[0013]優選的固態培養基組分和添加量如下:水分的添加量為600g/kg。豆柏225g/kg，米糠75g/kg時，麥芽浸粉30g/kg。
[0014]本發明所述凝結芽孢桿菌的名稱為TQ33,分類名稱Bacillus coagulans,保藏編號為=CGMCC N0.5233保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0015]所述凝結芽孢桿菌的種子液培養基的組成(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖 20.0，初始 ρΗ7.2-7.4。
[0016]種子液的培養條件:溫度37±1°C，轉速為ZOOr.mirT1，培養時間18h。
[0017]本發明使用生理鹽水(超純水配制)提取苯乳酸，將固態發酵樣品和超純水以1:4的比例混合，在4°C冰箱里放置4h后提取上清液，離心過膜后，利用高效液相測量苯乳酸的含量。
[0018]本發明所用的HPLC的條件
[0019]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4=Z腈90:10 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0020]苯丙酮酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB-C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4:乙腈93:7 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.4111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0021]苯丙氨酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱,流動相為ImM H2SO4:乙腈95:5 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.2111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0022]有益效果:
[0023]本發明利用凝結芽孢桿菌固態發酵，通過底物的添加提高苯乳酸的產量，最終獲取富含苯乳酸的飼料。這是首次通過固態發酵來提高苯乳酸產量，并且將獲取的苯乳酸直接應用到發酵制劑中，省去了苯乳酸提取，分離等的下游處理工藝，既提高了這種飼料的利用價值，也不會增加這種固態發酵飼料的成本。
[0024]利用固態培養基發酵凝結芽孢桿菌獲得的固態制劑本身就具有益生菌的效果，添加在詞料里面，具有提聞動物的免疫力，促進動物生長等益生功能，在養殖業具有廣闊的應用價值。固態制劑中苯乳酸產量的提高增強了凝結芽孢桿菌的益生功能，提高了這種固態制劑的利用價值，使這種固態制劑擁有更廣泛的應用價值。
[0025]本發明的有益效果還在于通過凝結芽孢桿菌固態發酵提高了苯乳酸的產量，通過固態培養基的優化以及底物的添加確定了固態發酵飼料中苯乳酸的最終產量為815mg/kg。凝結芽孢桿菌是一種益生菌，利用其固態發酵所得到的制劑具有益生菌的多重功效。苯乳酸是一種新型的抑菌物質，具有增強動物免疫力，提高畜禽肉質，降低家畜體內的大腸桿菌數量等功能。固態發酵中苯乳酸含量的提高，使凝結芽孢桿菌能更好的發揮益生功能，從而進一步提高了這種固態發酵飼料的利用價值，這樣的固態制劑在畜禽養殖業中具有更高的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1 (a)苯乳酸標樣和樣品的液相圖譜，(b)苯丙酮酸標樣和樣品的液相圖譜，(C)苯丙氨酸標樣和樣品的液相圖譜
[0027]圖2固態發酵生長曲線以及pH的變化
[0028]圖3苯乳酸取樣時間的確定
[0029]圖4水分添加量對苯乳酸產量的影響
[0030]圖5豆柏，米糠比例對苯乳酸產量的影響
[0031]圖6麥芽浸粉對苯乳酸產量的影響
[0032]圖7接種量對苯乳酸產量的影響
[0033]圖8苯丙酮酸不同添加量對苯乳酸產量的影響以及苯丙酮酸的轉化率
[0034]圖9苯丙氨酸的添加量對苯乳酸的影響以及苯丙氨酸的轉化率
【具體實施方式】
[0035]下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
[0036]本發明使用的菌種為凝結芽孢桿菌TQ33,分類名稱Bacillus coagulans,保藏編號為:CGMCC N0.5233，保藏日期:2011年9月9日，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0037]斜面培養基、種子培養基
[0038]斜面培養基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏5.0、葡萄糖12.0、瓊脂20.0初始ρΗ7.0-7.2。
[0039]種子培養基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0，初始ρΗ7.2-7.4。
[0040]固態培養基
[0041]最終確定的固態培養基是由豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麥芽浸粉30g/kg和水600g/kg苯丙酮酸2.7g/kg或者苯丙氨酸3.0g/kg組成；培養基混勻分裝后115°C滅菌20mino
[0042]實施例1
[0043]I菌種活化
[0044]挑取甘油管里面的菌體一平板培養24h —挑取菌體，接入斜面，培養24后，4°C冰箱保存。
[0045]2種子液培養
[0046]挑取斜面菌體2環，接入種子液，37± I°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態
培養基。
[0047]3固態發酵
[0048]I)固態培養基組成:水分500g/kg，麥芽浸粉10g/kg，豆柏200g/kg，米糠200g/kg,混合均勻后分裝，115°C滅菌20min。[0049]2)固態培養基的培養:按照固態培養基重量的5%接入種子液，37土 1°C，相對濕度80%左右培養，分別在0、3、6、12、24、36、48、60、72h取樣。
[0050]3)確定不同時間的菌體數以及pH變化:將不同時間所取樣品裝入三角瓶中(三角瓶裝有生理鹽水和玻璃珠)后，在搖床搖勻大約lh，吸取上清液移到試管(每根試管9ml生理鹽水)中進行梯度稀釋；稀釋好的液體，移到平板中與培養基混勻后37±1°C培養；另外，稀釋好的菌液，在80°C中水浴lOmin，測其的芽孢數；另外，利用pH儀測量三角瓶中樣品稀釋液，記錄其數值。
[0051]4)苯乳酸的提取:將不時間的發酵樣品與生理鹽水以1:4的比例混勻，在4°C冰箱里靜止4h后，提取上清液，離心過膜。
[0052]4苯乳酸濃度的檢測
[0053]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱,流動相ImM H2SO4:乙腈90:10 (v/v)，進樣量為 1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。 [0054]結果表明:從繪出的固態發酵生長曲線以及pH變化(附圖2)可以看出，凝結芽孢桿菌在固態培養基中培養48h左右達到穩定期，48h以后菌體量變化不大；發酵過程中，pH的變化先下降，36h時pH最低，此后固態培養基的pH開始上升。從繪制的苯乳酸取樣時間(附圖3)可以看出:苯乳酸在對數期就開始產生，但是36h之前產量很少，并且不同時間的產量差異也小，36h后苯乳酸的產量開始升高，在60h苯乳酸的積累量達到最大為121mg/
kg ο
[0055]實施例2
[0056]I種子液培養
[0057]挑取斜面菌體2環，接入到種子液中，37°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態培養基。
[0058]2固態發酵
[0059]I)固態發酵培養基的組成:固態培養基中的水分添加量分別為500g/kg，550g/kg,600g/kg,700g/kg ;麥芽浸粉,豆柏與米糠添加量分別為10g/kg, 200g/kg, 200g/kg,混勻以后115°C滅菌20min。
[0060]2)固態發酵:按照固態培養基重量的5%接入種子液，37± 1°C,相對濕度80%左右培養，60h取樣；樣品與生理鹽水以1:4的比例混合，4°C冰箱里靜止4h，提取上清液，離心過膜。
[0061]3苯乳酸含量的測量
[0062]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱,流動相ImM H2SO4:乙腈90:10 (v/v)，進樣量為 1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0063]結果表明:由附圖4可以看出，固態培養基中水分添加量為600g/kg時，苯乳酸產量最高，由此確定固態培養基中水分的添加量為600g/kg。
[0064]實施例3
[0065]I種子液培養
[0066]挑取斜面菌體2環，接入到種子液中，37°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態培養基。
[0067]2固態發酵[0068]I)固態發酵培養基組成:固態發酵培養基中水分的添加量為600g/kg，麥芽浸粉為 10g/kg,豆柏，米糠的添加量分別為 150g/kg, 150g/kg ；200g/kg, 100g/kg ；100g/kg, 200g/kg ；225g/kg, 75g/kg ；75g/kg, 225g/kg。
[0069]2)固態發酵:按照固態培養基重量的5%接入種子液，37土 1°C相對濕度80%左右培養，60h取樣；樣品與生理鹽水1:4的比例混合后4°C冰箱里靜止4h，提取上清液，離心過膜。
[0070]3苯乳酸含量的測定
[0071]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4:Zj腈90: 10 (v/v)，進樣量為IOyL,流速為0.7mL/min，柱溫為30°C，檢測波長210nm。
[0072]結果表明:根據結果繪制的圖(附圖5)可以看出，豆柏的含量對苯乳酸的產量有很大影響，豆柏225g/kg，米糠75g/kg時，苯乳酸的產量最大。
[0073]實施例4
[0074]I種子液培養
[0075]挑取斜面菌體2環，接入到種子液中，37°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態培養基。
[0076]2固態發 酵
[0077]I)固態培養基的組成:固態發酵培養基中水分的添加量為600g/kg，豆柏225g/kg,米糠75g/kg,麥芽浸粉添加量分別為10g/kg, 20g/kg,30g/kg,40g/kg,混勻后分裝，115°C 滅菌 20min。
[0078]2)固態培養基的培養:按照固態培養基重量的5%接入種子液，37± I°C，相對濕度80%左右培養，60h后取樣與生理鹽水以1:4的比例混合，混勻后4°C冰箱里靜止4h提取苯乳酸，過膜。
[0079]3苯乳酸含量的檢測
[0080]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4:Zj腈90:10 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0081]結果表明:(附圖6)可以看出，隨著麥芽浸粉添加量的增加，苯乳酸的產量逐漸增加，當麥芽浸粉的添加量為30g/kg時，苯乳酸產量最大，超過此添加量濃度時，苯乳酸產量降低。
[0082]實施例5
[0083]I種子液培養
[0084]挑取斜面菌體2環，接入到種子液中，37°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態培養基。
[0085]2固態發酵
[0086]I)固態發酵培養基組成:水分添加量為600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麥芽浸粉30g/kg,混勻后滅菌。
[0087]2)固態發酵:分別按照固態培養基重量的為5%，8%，10%, 12%接種；固態發酵培養基37 ± I °C，相對濕度80%左右培養；60h后取樣與生理鹽水以1:4的比例混合，混勻后4°C冰箱里靜止4h提取上清液，過膜。
[0088]3苯乳酸含量的檢測[0089]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4:Zj腈90:10 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0090]結果表明:通過(附圖7)可以看出，接種量為10%的時候，苯乳酸的產量最大為137mg/kg。
[0091]實施例6
[0092]I種子液培養
[0093]挑取斜面菌體2環，接入到種子液中，37°C，200r.mirT1通風培養，18h后轉接到固態培養基。
[0094]2固態發酵
[0095]I)固態培養基成分:水分添加量600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麥芽浸粉30g/kg ;另外，培養基中分別補加苯丙酮酸(g/kg)0.45,0.9,1.4,1.8,2.1 Λ.5混勻后115°C滅菌。
[0096]2)固態培養基成分:水分添加量600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麥芽浸粉30g/kg ;另外，培養基中分別補加苯丙氨酸(g/kg)0.5、1.0、1.5,2.0,3.0、4.5混勻后115°C滅菌。
[0097]3)固態培養基的培養:兩種培養都按照固態培養基重量的10%接入種子液，培養基37 ± I °C，相對濕度80%左右培養，60h后取樣與生理鹽水以1:4的比例混合，混勻后4°C冰箱里靜止4h提取苯乳酸，過膜。
[0098]3苯乳酸含量的檢測以及苯丙氨酸，苯丙酮酸剩余含量的檢測
[0099]苯乳酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱,流動相ImM H2SO4:乙腈為90:10 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.7111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0100]苯丙酮酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB-C18色譜柱，流動相為ImM H2SO4:乙腈為93:7 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.4111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0101]苯丙氨酸檢測的液相條件:Agilent ZorbaxSB_C18色譜柱,流動相為ImM H2SO4:乙腈為95:5 (v/v)，進樣量為1(^1^，流速為0.2111171^11，柱溫為301:，檢測波長21011111。
[0102]結果表明:(附圖8和9)可以看出苯丙酮酸和苯丙氨酸的添加有效的提高了苯乳酸的產量，但不同的是菌體對苯丙氨酸的利用比較好，其添加量為2.7g/kg時苯乳酸產量可達815mg/kg，是未添加底物時苯乳酸產量的6倍，此時苯丙酮酸的轉化率也最大，為98.7% ;而對于苯丙氨酸來說，其添加量為3g/kg時，苯乳酸產量最大為752mg/kg，是未添加底物苯乳酸產量的5.5倍，轉化率最大為94.9%。
[0103]實施例7凝結芽孢桿菌固態發酵飼料對高產蛋雞產蛋性能的影響
[0104]1.將最終獲得的固態發酵飼料進行動物試驗，選取34周齡健康商品代海蘭褐蛋雞600隨機分為5個處理組，每個處理組120只雞，每3只雞為I重復，即每處理組可以獲得40個重復觀察數據。
[0105]2.試驗進行49天，采用的基礎日糧組成以及營養成分見表1。
[0106]表1基礎日糧配方及營養水平
[0107]
【權利要求】
1.一種生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，由以下方法制得，凝結芽孢桿菌液體種子接入固態培養基中進行固態發酵培養，固態培養基的基本成分為豆柏，米糠，麥芽浸粉和水分，所述固態培養基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，固態發酵55-65h，發酵溫度為33-38°C，發酵室內的相對濕度控制在75-80%，發酵期間每隔12h翻勻一次，固態發酵培養后獲得固態發酵飼料。
2.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述固態培養基中各組分的的添加量如下:水分，豆柏，米糠，麥芽浸粉分別為500-700g/kg, 200-250g/kg, 50-100g/kg, 20_50g/kg。
3.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述固態發酵培養基接種量范圍為5-15%。
4.根據權利要求3所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述固態發酵培養基接種量為10%。
5.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，所述苯丙酮酸的添加濃度為2-3g/kg。
6.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量為2.5-3.5g/kg時。
7.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述固態培養基組分和添加量如下:水分的添加量為600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg時，麥芽浸粉30g/kg。
8.根據權利要求1所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，其特征在于，所述凝結芽孢桿菌的名稱為TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏編號為=CGMCCN0.5233。
9.根據權利要求1-8所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料的制備方法，包括如下步驟:凝結芽孢桿菌液體種子接入固態培養基中進行固態發酵培養，固態培養基的基本成分為豆柏，米糠，麥芽浸粉和水分，所述固態培養基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，固態發酵55-65h，發酵溫度為33-38°C，發酵室內的相對濕度控制在75_80%，發酵期間每隔12h翻勻一次，固態發酵培養后獲得固態發酵飼料。
10.根據權利要求1所述所述的生產富含苯乳酸凝結芽孢桿菌固態發酵飼料，所述固態發酵制劑在飼料中的最佳添加濃度為0.15%。
【文檔編號】A23K1/14GK103636923SQ201310544807
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】王海寬, 路福平, 張會圖, 高雪芹 申請人:天津科技大學