一種小單孢菌發酵生產慶大霉素的培養基及培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵技術領域，特別是涉及一種小單孢菌發酵生產慶大霉素的培養基 及培養方法。
【背景技術】
[0002] 慶大霉素是由放線菌屬小單孢菌發酵產生的氨基糖苷類廣譜抗生素，1963年被美 國人Weinstein首次發現，1969年被用于臨床，是各種革蘭氏陰性菌感染的主要抗菌藥物 之一。目前，國內采用小單孢菌發酵生產慶大霉素，存在的主要問題是：
[0003] 1發酵生產工藝變化不大，發酵單位維持在1500u/ml左右，導致發酵產量較低。
[0004] 2發酵培養基含有的動物性氮源質量影響發酵液質量和發酵效果。目前，國內發酵 生產慶大霉素的培養基中加入玉米蛋白粉或魚粉或二者同時加入，導致發酵后期剩余蛋白 質較多，發酵液粘度較高，降低了提取收率。
[0005] 3慶大霉素的生產成本較高，其中氮源的成本占到發酵成本的30%左右。
【發明內容】
[0006] 本發明目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種有效提高發酵單位，同時 最大限度的降低原輔料用量，降低生產成本，且原輔料來源不受環境影響，保證其供應充 足，實現慶大霉素穩定、高效生產的小單孢菌發酵生產慶大霉素的培養基。
[0007] 本發明的另一目的是提供利用上述培養基生產慶大霉素的培養方法。
[0008] 為實現上述目的所采取的技術方案為：
[0009] -種小單孢菌發酵生產慶大霉素的培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養 基和發酵培養基，其特征在于所述一級種子培養基的組成為：麥芽糖10~20ml/L、混合 淀粉20~30g/L、豆油或玉米油1~5ml/L、低溫壓榨一次黃豆餅粉25~35g/L、大米酒 糟15~20g/L、玉米蛋白粉5~10g/L、輕質碳酸興2~4g/L、硫酸銨1~5g/L，麥芽糖酶 0? 01 ~0? 03g/L ;
[0010] 所述二級種子培養基組成為：麥芽糖20~25ml/L、混合淀粉30~40g/L、豆油或 玉米油1~5ml/L、低溫壓榨一次黃豆餅粉40~45g/L、大米酒糟25~30g/L、玉米蛋白粉 10~15g/L、磷酸二氫鉀0. 5~0. 8g/L、輕質碳酸興3~5g/L、硫酸銨3~5g/L、麥芽糖酶 0? 03 ~0? 05g/L ;
[0011] 所述發酵培養基的組成為：麥芽糖30~50ml/L、混合淀粉40~60g/L、豆油或玉 米油1~5ml/L、低溫壓榨一次黃豆餅粉50~60g/L、大米酒糟30~40g/L、玉米蛋白粉 20~30g/L、磷酸二氫鉀0? 8~1. 2g/L、輕質碳酸興6~8g/L、硫酸銨5~8g/L、氯化鈉4~ 6g/L、硫酸鎂4~6g/L、氯化鈷0? 003~0? 007g/L、非離子表面活性劑0? 01~0? 05g/L，弱 酸性陽離子交換樹脂1~5g/L，麥芽糖酶0. 04~0. 07g/L。
[0012] 所述大米酒糟的質量要求是：蛋白質含量在50%以上，水分含量控制在5%以內， 80%的原料能夠通過60目篩。
[0013] 所述低溫壓榨一次黃豆餅粉質量要求是：黃豆餅粉在低于80°C的條件下壓榨1 次，要求其油含量控制在7~10%，蛋白質含量在45%以上，80%的原料能夠通過80目篩。
[0014] 所述混合淀粉是指淀粉中加入其重量的0. 006%的泛酸和0. 004%的硫辛酸。
[0015] 所述非離子表面活性劑為脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯。
[0016] 所述弱酸性陽離子交換樹脂為大丙烯酸系陽離子交換樹脂、苯丙烯陽離子交換樹 脂或酚醛陽離子交換樹脂。
[0017] 一種利用上述培養基生產慶大霉素的培養方法，其特征在于其工藝步驟包括：
[0018] 1) 一級種子培養：首先將一級種子培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后在 火焰保護下，將已經培養好的小單孢菌母瓶發酵液接入一級種子罐進行培養，接種量控制 在一級種子培養基體積的0. 5~1% ;
[0019] 2)二級種子培養：先將二級種子培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將已 經培養好的菌體濃度15~25%、pH值7~8、無其它雜菌污染的一級種子培養液按照1:9~ 11 (體積比）比例移入二級種子罐進行培養；
[0020] 3)發酵培養：先將發酵培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將已經培養好 的菌體濃度30~40%、pH值7~8、無其它雜菌污染的二級種子液按照1: 5~6 (體積比） 比例移入發酵罐進行培養，至a發酵效價每6~8h取樣檢測，前、后檢測的發酵單位相差在 100u/ml以內；b菌體濃度30~50% ;c發酵單位在2200u/mL以上；d pH值6. 5~8. 5時 停止發酵。
[0021] 所述一級種子培養條件為：罐壓0. 04~0. 08MPa ;罐溫34~37°C;空氣流量：0~ 10h，50~60m3/h ;6h~移種：80~100m3/h ;攬祥轉速60~100r/min ;pH7~8 ;培養時間 50 ~55h〇
[0022] 所述二級種子培養條件為：罐壓0. 04~0. 08MPa ;罐溫33~35°C;空氣流量100~ 300m3/h ;攪拌轉速100~120r/min ;pH值7~8 ;培養時間：40~50h。
[0023] 所述發酵培養條件為：
[0024] a脂肪控制：發酵培養基滅囷后脂肪控制在4~6%;發酵如80h，脂肪含量控制在 4. 5%以上；發酵81~110h，脂肪含量控制在3. 5~4.5% ;lllh至發酵結束，脂肪含量控 制在1. 5~2% ;
[0025] b發酵過程采用變溫培養：
[0026] 發酵前60h，培養溫度控制在35~37°C，
[0027] 發酵61h~發酵結束，培養溫度控制在34~35°C ;
[0028] c 攪拌轉速：150 ~220r/min ;
[0029] d還原糖含量：發酵培養基滅菌后還原糖控制在6~8%;發酵前80h，還原糖含量 控制在6%以上；發酵81~110h，還原糖含量控制在4~6%;發酵lllh至發酵結束，還原 糖含量控制在1~2% ;
[0030] e發酵周期：培養時間150~160h ;
[0031] f壓力控制：發酵全程罐壓控制在0? 06~0? 08MPa ;
[0032] g pH控制：發酵過程中pH6. 5~7. 5 ;
[0033] h無菌檢查：發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
[0034]i空氣流量：發酵前80h :400~600m3/h ;發酵81~110h，800~1000m3/h ;發酵 lllh至發酵結束，300~500m3/h。
[0035] 在發酵過程中進行補料，包括補油、補水、補糖、補堿和補氮源，其中
[0036] a補油控制：采用流加法補豆油或玉米油，
[0037] 發酵前80h不用進行補油，
[0038]發酵81h~110h，脂肪含量控制在3. 5~4. 5%，當脂肪含量低于4%，補入油，當 脂肪含量超過6%，則停止補油，補油量（L) = (5-脂肪含量-殘油量）％ X發酵液體積 (L),
[0039]發酵81~110h，脂肪含量控制在3. 5~4. 5 %，當脂肪含量低于3. 5 %，補入油，當 脂肪含量超過4. 5%，則停止補油，補油量（L) = (4-脂肪含量-殘油量）％ X發酵液體積 (L),
[0040] 發酵lllh至發酵結束，脂肪含量控制在1. 5~2%，當脂肪含量低于1. 5%，補入 油，當脂肪含量超過2%，則停止補油，補油量（L) = (1.7-脂肪含量-殘油量X發酵 液體積（L);
[0041] b 補水：
[0042] 發酵前60h不用進行補水，
[0043] 發酵61h~100h，當發酵液菌體濃度> 50%，采用流加法補水，控制菌體濃度 40 ~50%，
[0044] 發酵101h至發酵結束：當發酵液菌體濃度> 40%，采用流加法補水，控制菌體濃 度30~40% ;
[0045] c 補堿：
[0046] 發酵前60h，pH不進行控制，
[0047] 發酵6 lh至發酵結束：10~20 %的氫氧化鈉溶液控制其pH在6. 5~7. 5 ;
[0048] d補入氮源：在發酵周期分別在60h和100h時補入5~10%的氨水，其補入量為 發酵液體積的1~1. 5% ;
[0049] e 補糖：
[0050] 發酵前80h，不加入麥芽糖，
[0051] 發酵81~110h，當還原糖含量< 4%，加入麥芽糖，當還原糖含量超過6 %，則停止 加入麥芽糖，補糖量（kg) = (5-還原糖量）％ X發酵液體積（L)，
[0052]發酵lllh至發酵結束，當還原糖含量< 1 %，加入麥芽糖，當還原糖含量超過2%， 則停止加入麥芽糖，補糖量（kg) =