快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，該方法是待小孢子胚狀體產生時，將其轉到2000lx、25℃、60r/min搖床上振蕩培養，3～7d后將轉綠的子葉型胚轉移到含蔗糖2.5%，瓊脂粉1%的B5固體培養基上繼續培養獲得再生芽；15～20d后，轉入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%瓊脂粉的MS固體培養基中，20～30d后大多數植株長成健壯且生根的幼苗，可馴化移栽，培養條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25℃。再生植株平均成苗率達83.5%。本發明有效解決小孢子胚易褐化、玻璃化的問題；有效縮短利用游離小孢子培養獲得DH株系的時間；不需添加任何激素，更安全。
【專利說明】快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，屬于植物組織培養【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蕓薹屬蔬菜屬于異花授粉植物，雜種優勢明顯，在育種上獲得一個純系需要5~7年的時間，而游離小孢子培養可以在I~2年獲得雙單倍體植株，大大節省純化時間和工作量。同時由于再生群體中單倍體的存在也有利于隱性性狀的表達，豐富了育種資源。此外，游離小孢子屬于單細胞，應用于誘變育種、突變體篩選和基因轉化等有其特殊的優勢，自發或人工加倍獲得的DH群體更是進行分子標記和繪制基因圖譜的理想材料。
[0003]游離小孢子培養技術，是由Lichter (1982)在甘藍型油菜上首創的單細胞培養技術，隨后加拿大、德國等國家相繼開展了此項研究工作，提高了小孢子的胚誘導頻率，于20世紀80年代末初步建立了甘藍型油菜的小孢子培養體系。此后小孢子培養技術在蕓薹屬不同蔬菜中得到了迅速發展，創造了從花蕾機械分離小孢子的方法，確立了可提高誘導率的花蕾標準并將熱激處理用于培養，并在芥菜、結球甘藍、花椰菜、青花菜、大白菜等作物上獲得成功。我國在游離小孢子培養方面的研究起步較晚，主要是借鑒國外的經驗，但發展迅速。20世紀90年代，曹鳴慶等(1993)、陳玉萍等(1998)和嚴準等(1999)分別首次在不結球白菜、紫菜薹和球莖甘藍等作物的游離小孢子培養上獲得成功。2003年，朱允華等(2003)首次報道菜心游離小孢子培養成功。此外蕓薹屬蔬菜中青花菜、芥藍、花椰菜也先后獲得了小孢子再生植株。
[0004]但前 人的研究主要聚焦在高效誘導胚狀體的產生方面，對小孢子胚再生植株頻率的研究甚少，而且缺乏深入的研究。但對于育種工作者來說，小孢子植株遠比小孢子胚更具有實際意義。因此，如何獲得高頻率的小孢子再生植株非常關鍵，也是目前獲得小孢子再生植株群體(DH)的主要限制因素。劉凡等(1997)的研究發現，小孢子胚能否順利發育成植株，受內外兩種因素的限制。小孢子胚在分化、繼代培養過程中存在著褐化、玻璃化等現象，直接影響小孢子植株的再生率，因此本發明旨在建立穩定高頻的不結球白菜和青花菜游離小孢子培養再生植株體系。
【發明內容】
[0005]本發明目的在于針對上述現有技術中獲得游離小孢子再生植株存在的成苗效率低的問題，提供一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法。
[0006]本發明的目的是通過以下方式實現的:
[0007]—種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)花蕾的選擇、預處理和滅菌:在初花期和盛花期，選取發育時期為單核靠邊期的花蕾；將花蕾保濕并置于冰箱中冷藏靜置24h后滅菌；[0009](2)小孢子分離與純化:向滅菌后的花蕾中加入B5-13液體培養基，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后過濾，收集濾液，離心，棄上清液，得到純化后的小孢子；所述的花蕾與B5-13液體培養基的比例為每28-32個花蕾中加入I~2ml的B5-13液體培養基。
[0010](3)培養液的分裝、熱激誘導:將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養基重新懸浮，然后分裝，小孢子密度I蕾/ml，封口后、熱激誘導；
[0011](4)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養，2~3周后出現肉眼可見的胚狀體；
[0012](5)振蕩培養:將上述胚狀體轉到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養；
[0013](6)誘導再生植株:振蕩培養3~7d后將轉綠的子葉型胚轉移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養基上繼續培養獲得再生芽，15~20d后，將其轉入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%瓊脂的MS固體培養基中，培養20~30d。 [0014]上述單核靠邊期對應的花蕾長度不結球白菜為2.0~3.0mm,青花菜為3.0mm~
4.0mm ；
[0015]所述的B5-13液體培養基為小孢子提取液，是通過以下方法制備得到的:分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入130g鹿糖,攪拌至完全溶解，定容至1000ml,然后調pH至
6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0016]所述的1/2NLN液體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取NLN培養基的大量元素25ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、絲氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,攪拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后調pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌。
[0017]所述的B5固體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入25g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入IOg瓊脂粉,攪拌至完全溶解，調pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0018]所述的MS固體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取MS培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入30g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入7.8g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
[0019]步驟(6)中再生植株的培養條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
[0020]所述的滅菌步驟是將預處理后的花蕾依次用體積濃度為75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，無菌水沖洗。
[0021]所述的熱激誘導是將小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗靜置24h。
[0022]所述的花蕾的選擇是通過醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發育時期及與花蕾長度的對應關系，準確找到發育時期為單核靠邊期的花蕾。
[0023]培養基中的大量元素可為NH4NO3、KNO3、MgSO4.7H20、(NH4)2S04、NaH2PO4.H2O、Ca(NO3)2 MH2CKKH2PO4XaCl2 中的一種或多種。微量元素可為 MnSO4.H2O、H3B03、ZnSO4.7Η20、K1、Na2MoO4.2H20、CuSO4.5H20、CoCl2.6Η20 中的一種或多種。Fe 鹽可為=Na2-EDTA,FeSO4.7Η20中的一種或多種。有機元素可為肌醇、煙酸、VB6, VB1、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、谷胱甘肽、葉酸、生物素中的一種或多種。
[0024]上述快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，具體包括如下步驟:
[0025](I)花蕾的選擇:在初花期和盛花期，通過醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發育時期及與花蕾長度的對應關系，準確找到發育時期為單核靠邊期的花蕾；
[0026](2)花蕾預處理:將選取的適宜花蕾保濕并置于4°C冰箱中處理24h ；
[0027](3)滅菌:選取的花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用7% (v/v)的NaClO溶液消毒15min，最后用無菌水沖洗3次，每次3~5min ；
[0028](4)小孢子分離與純化:將消毒后的花蕾置于研缽中,加入I~2ml B5_13液體培養基，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用300目濾網過濾，將濾液收集于IOml離心管，1000rpm離心3min,棄上清液,重復3次；
[0029](5)培養液的分裝:將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養基重新懸浮，然后分裝于60X 15mm培養皿中，每皿3ml，小孢子密度約I蕾/ml，用Parafilm膜封Π ；
[0030](6)熱激誘導:將上述小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗處理24h ；
[0031](7)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養，2~3周后即可出現肉眼可見的胚狀體；
[0032](8)振蕩培養:將上述胚狀體轉到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養；
[0033](9)誘導再生植株:振蕩培養3~7d后將轉綠的子葉型胚轉移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養基上繼續培養獲得再生芽，15~20d后，將其轉入含10%椰汁，3%蔗糖，
0.78%瓊脂的MS固體培養基中，20~30d即可長成健壯且生根的幼苗，可馴化移栽；
[0034]游離小孢子培養的各種母液配方如下:`[0035]
【權利要求】
1.一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)花蕾的選擇、預處理和滅菌:在初花期和盛花期，選取發育時期為單核靠邊期的花雷；將花雷保濕并直于冰箱中冷減靜直24h后滅囷； (2)小孢子分離與純化:向滅菌后的花蕾中加入B5-13液體培養基，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后過濾，收集濾液，離心，棄上清液，得到純化后的小孢子；所述的花蕾與B5-13液體培養基的比例為每28-32個花蕾中加入I~2ml的B5-13液體培養基。 (3)培養液的分裝、熱激誘導:將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養基重新懸浮，然后分裝，小孢子密度I蕾/ml，封口后、熱激誘導； (4)胚狀體形成:將熱激后的小孢子懸浮液于25°C黑暗靜置培養，2~3周后出現肉眼可見的胚狀體； (5)振蕩培養:將上述胚狀體轉到20001x、25°C、60r/min搖床上振蕩培養； (6)誘導再生植株:振蕩培養3~7d后將轉綠的子葉型胚轉移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養基上繼續培養獲得再生芽，15~20d后，將其轉入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%瓊脂的MS固體培養基中，培養20~30d。
2.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:單核靠邊期對應的花蕾長度不結球白菜為2.0~3.0mm,青花菜為3.0mm~4.0mnin
3.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:所述的B5-13液體培養基為小孢子提取液，是通過以下方法制備得到的:分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入130g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,然后調pH至6.0~6.2 ;于121。。，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
4.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:所述的1/2NLN液體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取NLN培養基的大量元素25ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再依次加入肌醇0.lg、谷氨酰胺0.8g、絲氨酸0.lg、谷胱甘肽0.03g、鹿糖130g,攪拌至完全溶解后，定容至1000ml,然后調pH至6.0~6.2 ;采用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌。
5.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:所述的B5固體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入25g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入IOg瓊脂粉,攪拌至完全溶解，調pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
6.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:所述的MS固體培養基是通過以下方法制備得到的:分別吸取MS培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素IOml四種母液,椰汁100ml混合到500ml蒸懼水中，混勻，再加入30g鹿糖,攪拌至完全溶解,定容至1000ml,加熱至沸騰后,加入7.8g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調pH至5.8~6.0 ;在121°C，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。
7.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于:步驟(6)中再生植株的培養條件都為90uE/m2/s、12hr/d、25°C。
8.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的滅菌步驟是將預處理后的花蕾依次用體積濃度為75%的酒精和7% (v/v)的NaClO溶液消毒，無菌水沖洗。
9.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的熱激誘導是將小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗靜置24h。
10.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的花蕾的選擇是通過醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發育時期及與花蕾長度的對應關系，準確找到發育時期為單核靠邊期的花蕾。
【文檔編號】A01H4/00GK103718965SQ201310726458
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】李英, 劉環環, 侯喜林, 劉同坤 申請人:南京農業大學