一種短小芽孢桿菌菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種短小芽孢桿菌菌株，其保藏編號為CCTCC M2013263。本發明的短小芽孢桿菌能夠改善對蝦消化道優勢菌群的組成和數量，形成并維持良好的消化道微生態平衡，通過營養競爭、空間競爭或分泌細菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖。能夠激活對蝦酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、熱休克蛋白、脂多糖-葡聚糖結合蛋白、信號傳導及轉錄激活因子等與抗病原感染相關分子的表達，減緩病毒在對蝦體內的增值速率。本發明的短小芽孢桿菌可以添加到對蝦飼料原料中，也可以直接施用于對蝦養殖水環境中。CCTCC M 201326320130616
【專利說明】一種短小芽孢桿菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于益生菌篩選【技術領域】，具體涉及一種短小芽孢桿菌菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)在細菌分類上隸屬于厚壁菌門（Firmicutes) (低G+C革蘭氏陽性菌）、芽孢桿菌綱（Bacilli)、芽孢桿菌目（Bacillal es)、芽孢桿菌科 (Bacillaceae)、芽孢桿菌屬（Bacillus)。短小芽孢桿菌普遍存在于土壤及植物體表，也是 人、動物腸道內常見的共生菌之一。短小芽孢桿菌是1989年美國食品藥物管理局（FDA)和 美國飼料公定協會（AAFCO)公布的44種可直接飼喂且通常認為是安全的微生物之一。短小 芽孢桿菌分泌蛋白能力強且胞外蛋白酶活性低，因此具有分泌表達外源蛋白的天然優勢， 利用它們可望建立高效的原核分泌表達系統。
[0003] 短小芽孢桿菌和其它芽孢桿菌一樣，具有營養體-芽孢-營養體的獨特生活周期 史，抗逆能力強、繁殖速度快、營養要求簡單，具有可抵抗酸、高溫、干燥等不良環境條件等 優勢，適宜大規模產業化發酵生產。短小芽孢桿菌在生長過程中可分泌蛋白酶、纖維素酶、 淀粉酶、幾丁質酶、脂肪酶、麥芽糖酶、多聚糖降解酶、堿性蛋白酶、β -半乳糖苷酶、果聚糖 酶等多種酶類，其豐富的胞外酶系不僅有助于飼料的消化吸收，可降解內外環境中的有機 殘余物，促進良性生態循環。短小芽孢桿菌的防病能力源于對養殖對蝦體內外生態環境的 改善和機體免疫力的提高，將其應用到水產養殖環境改良劑、飼料添加劑等有廣闊的前景。
[0004] 但目前對蝦養殖生產中應用的短小芽孢桿菌菌株較少，且存在著菌種生物學性狀 平平，活菌數量偏低，作用效果不穩定等不足，特別是還沒有抗對蝦病毒病菌株的應用。病 毒性疾病是危害對蝦養殖生產的主要病害，約占對蝦病害總損失率的六成；特別是對蝦白 斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,簡稱WSSV)引起白斑病，由于宿主范圍廣、感 染死亡率高，是我國乃至全世界影響最大、危害最為嚴重的病毒性疾病。本發明涉及的短小 芽孢桿菌菌株，優先考慮菌株的抗病毒活性，通過反復養殖實驗證實該菌株可提高對蝦溶 菌酶、過氧化氫酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相關免疫酶活性，增強對蝦非特異 免疫功能，減少病毒感染的機會，從而有效阻斷病毒病的發生與流行。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種短小芽孢桿菌菌株及其應用，該菌株來源于對蝦消化 道，具有增強對蝦細胞和體液的免疫水平，特別是提高對蝦抗病毒感染能力的生物學活性。
[0006] 本發明的短小芽孢桿菌LV012 (Bacillus pumilus LV012)菌株于2013年6月16 日保藏在武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2013263。
[0007] 上述的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株是從對奸消化道中分離的。
[0008] 短小芽孢桿菌LV012菌株可用于制備短小芽孢桿菌LV012發酵菌液。
[0009] 短小芽孢桿菌LV012發酵菌液制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養基，在37°C培養24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養液中， 37°C搖瓶培養24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發酵液中發酵培養，發酵 溫度控制在37°C ;當發酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發酵，獲得發酵菌液；發酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0010] 短小芽孢桿菌LV012的發酵液成分質量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0011] 本發明的短小芽孢桿菌LV012篩選自對蝦消化道，具有：①改善對蝦消化道優勢 菌群的組成和數量，形成并維持良好的消化道微生態平衡，通過營養競爭、空間競爭或分泌 細菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；②通過提高對蝦溶菌酶、過氧化氫酶、酚氧化 酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相關免疫酶活性，增強對蝦非特異免疫功能，減少病毒感染 的機會；③激活對蝦酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、熱休克蛋白、脂多糖-葡聚糖結 合蛋白、信號傳導及轉錄激活因子等與抗病原感染相關分子的表達，減緩病毒在對蝦體內 的增值速率；④提高對蝦蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促進對蝦消化能力和飼料養分的 消化，提高對蝦抗應激反應能力等多種生物學功能。本發明的短小芽孢桿菌LV012可以添 加到對蝦飼料原料中，也可以直接施用于對蝦養殖水環境中。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合具體實施例對本發明的菌株進行詳細的描述。
[0013] 實施例1 :短小芽孢桿菌的篩選
[0014] 本發明的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株篩選自凡納濱對蝦消化 道。將采集的健康對蝦樣品放在盛有海水的充氣袋中運回實驗室。無菌操作臺上用75% 的酒精擦拭活蝦體表進行消毒，無菌操作將活蝦解剖，取出對蝦腸道組織。將取出的腸道 組織用無菌的PBS (pH = 7. 0)緩沖液沖洗3-4次后，用無菌研磨棒研磨均勻。之后用無菌 PBS緩沖液適當稀釋，取0. Iml涂布于2216E固體培養基上，倒置于28°C恒溫培養箱中培 養16h-20h。觀察2216E平板上細菌的菌落形態，對菌落形態一致的細菌進行編號，無菌條 件下用接種環挑取優勢菌單菌落接種于2216E海水固體培養基中進行反復純化培養。純化 后的單菌落接種于2216E海水液體培養基，在轉速為180rpm/min，28°C振蕩培養箱中培養 16h-20h，取0. 8ml菌懸液放入保種管中，再加入0. 2ml的70%滅菌甘油，混勻，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。
[0015] 篩選的短小芽孢桿菌在2216E培養基上的菌落形態：菌落直徑約l-2mm，菌落呈圓 形，乳白色、不透明，表面呈蠟狀，有凸起且邊緣整齊。
[0016] 碳源利用情況為α -環式糊精、β -甲基-D-葡萄糖苷、D -阿糖醇、腺苷、D-丙氨 酸、2' -脫氧腺苷、β -環式糊精、松二糖、L-丙氨酸、麥芽三糖、D-阿洛酮糖、木糖醇、D-蘋 果酸、D-甘露醇、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、L-天門冬酰胺、琥珀酸單甲基酯、D-甘露糖、 L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5' -磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、吐溫80、龍膽二糖、γ -羥丁 酸、P-羥基苯乙酸、β-甲基-D-半乳糖苷、α-酮戊二酸、2, 3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄 糖、苦杏仁苷在Biolog碳源消耗中呈現陽性。
[0017] 其它生理生化特性：淀粉水解呈陰性，明膠液化陰性，氧化酶試驗陽性，過氧化氫 酶試驗陽性。
[0018] 短小芽孢桿菌LV012菌株可用于制備短小芽孢桿菌LV012發酵菌液。
[0019] 短小芽孢桿菌LV012發酵菌液制備方法如下：從-80°c保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養基，在37°C培養24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養液中， 37°C搖瓶培養24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發酵液中發酵培養，發酵 溫度控制在37°C ;當發酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發酵，獲得發酵菌液；發酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0020] 短小芽孢桿菌LV012的發酵液成分質量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0021] 實施例2:
[0022] 將制得的IOOmL短小芽孢桿菌LV012溶液與IOKg基礎對蝦飼料原料（含魚粉 30%、蝦粉10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復合維生素1% )混合，制 成含短小芽孢桿菌LV012的免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分 混勻，以褐藻酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘 干至水分含量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存備用。
[0023] 健康凡納濱對蝦300余尾，實驗對蝦初始平均體長為6. 3cm，隨機為實驗組和對照 組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組養殖對蝦50尾。實驗組連續4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎飼料，7天一個循環，直至實驗結束。對照組在整個實驗階段一直投 喂基礎飼料。水溫24-26°C，連續充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為1. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據殘餌的多少調節投餌量。 免疫飼料養殖21天后，進行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實驗。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對蝦在第2腹節處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對照組。攻毒后各組繼續投喂相應飼料，每天及時 撿出死蝦，記錄死亡數量，14d后結束感染實驗。實驗組和對照組每日平均累計死亡率結果 見下表，實驗結果顯示在感染4d內，實驗組與對照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第5d始各組均呈明顯的上升趨勢，對照組累積死亡率較實驗組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實驗結束前1天對照組的累積死亡率為100%，實驗組的累積死亡率為63. 3%。
【權利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌，其特征在于，所述的短小芽孢桿菌的保藏編號為CCTCC M 2013263。
2. 權利要求1所述的短小芽孢桿菌是從對蝦消化道中分離的。
3. 權利要求1所述的短小芽孢桿菌在制備飼料添加劑中的應用。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的飼料為對蝦飼料。
5. -種對蝦飼料，其特征在于，所述的對蝦飼料中添加有權利要求1所述的短小芽孢 桿菌。
6. -種菌液，其特征在于，所述的菌液是用權利要求1所述的短小芽孢桿菌發酵制備 的。
7. 如權利要求6所述的菌液，其特征在于所述的菌液中短小芽孢桿菌活菌濃度 彡 109CFU/mL。
8. 發酵制備權利要求6所述菌液的方法，其特征在于，所述方法如下： 從-80°C保存的菌種挑取少量劃線于2216E固體培養基，在37°C培養24h獲得單菌落， 取一單菌落接種于2216E培養液中，37°C搖瓶培養24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣 芽孢桿菌發酵液中發酵培養，發酵溫度控制在37°C ;當發酵液0D600值達到1. 2?1. 4時， 終止發酵，獲得發酵菌液。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的發酵液成分質量百分比為：蛋白胨 0.5 % ;酵母粉0. 1% ;蔗糖1.5% ;氯化鈉2.5% ;硫酸鐵0.05 % ;硫酸鎂0.004 % ;硫酸 0? 01%。
【文檔編號】A23K1/18GK104388337SQ201410582638
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】宋曉玲, 李玉宏, 張慶利, 許華, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所