本發明涉及一種基于機械法獲取花藥的大麥花培方法，屬于農業科學技術領域。
背景技術：
大麥屬禾本科大麥屬一年生谷類植物，是一種主要的糧食和飼料作物，有30多個種，只有普通大麥（horderm vulgare L.）一個種具有栽培價值，包括二棱、多棱和中間型大麥3個亞種。作為工農業生產的重要谷類作物，全球現種植大麥6100多萬hm2，總產量約1.7億噸，面積和總產僅次于小麥、水稻、玉米，為第四大谷物。許多發達國家對大麥生產特別重視，這是與其發展啤酒工業和畜牧業，以提高人民生活質量相適應的。世界大麥面積分布依次為歐洲占50%以上，亞洲占20%～25%，美洲10%～15%，非洲占6%左右，大洋洲占5%左右。
大麥栽培歷史悠久，是第一個被馴化的谷類作物。據考證，早在新石器時代中期，古羌族（居住在青海）就已在黃河上游開始栽培，距今已有5000年的歷史。由于大麥具有早熟、耐旱、耐鹽、耐低溫冷涼、耐瘠薄等特點，因此栽培非常廣泛。椐統計，我國大麥種植面積在20世紀30年代曾達到9570萬畝，總產85億公斤；50年代，面積縮小到5809萬畝，總產34.5億公斤；70年代，面積又擴增到9750萬畝，總產99億公斤，每畝產量101.5公斤；現已縮減到1500萬畝，每畝產量266公斤，主要產區集中在長江流域、黃河流域和青藏高原。
近20年來我國啤酒工業發展迅速，現已成為世界第一啤酒生產大國，由于我國優質啤酒專用大麥品種選育研究滯后于啤酒工業的迅速發展，以及啤麥生產方式及設備等因素，我國的啤酒原料因質量問題而主要依賴進口。我國成為啤酒大麥的第一進口國，目前我國進口啤麥量占世界啤麥進口貿易量的一半以上，占我國啤麥需求的60%左右。由于全球啤酒工業的發展和大麥原料的緊缺，再加國外水、旱和病蟲害的影響，大麥進口極不穩定，國內企業易受國外價格的沖擊，我國啤酒業今后將面臨漲價的壓力。因此，努力實現啤酒原料國產化，對于促進我國啤酒工業的穩定發展具有十分重要的意義。
大麥籽粒的粗蛋白和可消化纖維均高于玉米，是牛、豬等家畜、家禽的好飼料。歐洲、北美的發達國家和澳大利亞，都把大麥作為牲畜的主要飼料。用大麥喂豬，在育肥期增加飼料中的大麥的比例，可使豬肉脂肪硬度大，熔點高，瘦肉多，肉質好。大麥還可以做青貯飼料，在灌漿期收割切段青儲，是奶牛的好飼料。
我國南方各省飼料嚴重緊缺，每年從北方調入上千萬噸玉米與豆粕等原料來彌補缺口，或直接以稻谷替代。在我國飼料工業中，近幾年大麥型配合飼料所必需的β-葡聚糖酶等飼料添加劑的研制與生產已取得成功的突破，大麥型配合飼料開始在我國南方進入快速發展階段。選育優質、高產飼料專用大麥新品種和建立飼麥生產基地等產業化網絡，利用南方大片冬閑地、海涂鹽堿地大力發展飼麥生產，對于解決我國南方地區飼料的供需矛質，促進該地區畜牧漁業的發展將發揮重大作用。盡管目前我國的大麥生產處于低谷階段，但是從國內對大麥的巨大需求和充分利用我國有限的土地資源這兩個重要的國情分析，我國的大麥生產應該和必將會得到迅速發展，大麥仍然是我國最具有發展潛力的谷物。
大麥新品種選育中應用單倍體技術可以簡化和加速育種程序，縮短育種時間5年左右，因而受到國內外育種家的青睞。早在1971年和1973年Clapham就報道首次得到了大麥花藥愈傷組織和花粉植株。自此，大麥花藥培養技術受到各國學者的普遍重視，花粉植株不僅是遺傳研究的良好群體，而且對單倍體育種也有實踐意義。現在花藥培養集成了雜交育種、誘變育種、細胞學、遺傳學等各種生物科學的內容，是大麥育種學發展的趨勢之一。
過去幾十年的育種改良過程中，我國大麥育種目標從提高產量到提升品質，有了很大的改變。我國大麥花藥培養在供體植株生長條件、花藥預處理方法、培養基成分和培養條件等進行了一系列的研究，使培養效率有了較大的提高，利用花藥培養技術成功育成了品種“單二”和“花30”和一些高產優質新品系。
然而，迄今為止，大麥花藥培養的去分化和分化頻率仍然較低，加之各基因型之間的差異很大，從而限制了該技術在育種上的應用。因此，進一步提高大麥花藥離體培養效率有非常重要的科學價值和實踐意義。影響大麥花藥培養效果的因索是多種多樣的，既包括由植株本身所決定的從基因型差異、花藥的發育時期及供體植株的生理狀態等內在條件；也包括基本培養基成分、激素及培養溫度等外界因素。從花培育種角度考慮，對于優良品種的改良和培育，往往需要從大量的花培后代中篩選優良家系，需要更大規模的培育花培子代，所以改善培養條件、提高花培效率是花培育種的最現實的需求。
現階段大麥花培育種在花藥培養方法上仍存在著工作量大、工作效率低的矛盾，限制了花培技術在大麥育種中的更廣泛的應用。如何提高工作效率、加快選擇效率、縮短育種周期、創新種質材料、配合其它生物技術的應用，快速獲得純系，充分利用花培技術在基礎理論研究和育種應用研究的雄厚基礎，成為我們迫切需要解決的問題。多年的實踐經驗發現，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限性，剪穎抖藥法是目前花藥分離最普遍的操作方法，然而，剪穎和抖藥過程既需要專業組培操作，又需要消耗大量的勞動，成為花培操作的限速步驟。如何快捷分離大麥花藥，并且保證分離后大麥花藥維持活力且無污染適宜離體培養，是解決花培操作低效的關鍵。
離心機是利用離心力，分離液體與固體顆粒或液體與液體的混合物中各組分的機械。離心機主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開，或將乳濁液中兩種密度不同又互不相溶的液體分開。利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點，有的沉降離心機還可對固體顆粒按密度或粒度進行分級。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有花藥離體培養操作方法的專業操作要求高且耗時耗力的缺陷，提供一種提高操作量、工作效率高的基于機械法獲取花藥的大麥花培方法。
本發明的目的是通過以下技術方案解決的：
一種基于機械法獲取花藥的大麥花培方法，其特征在于：所述花培方法的步驟如下：
（1）取穗及預處理；
（2）對預處理后的大麥穗進行滅菌；
（3）在無菌條件下將大麥穗進行機械分割，切碎的大麥穗倒入離心管中密封后置于搖床上震蕩；
（4）將初步震蕩后的離心管放入高速冷凍離心機中離心獲得離體花藥；
（5）對離體花藥進行接種和誘導培養出花藥愈傷組織；
（6）分化、繼代與移栽，完成該花培過程。
所述步驟（1）中的取穗以采集主莖上的圓錐花序且其花藥中的小孢子處于單核晚期為標準取穗；所述的預處理過程為：先用75%乙醇表面消毒，然后用濕潤的紗布包裹整個大麥穗，保持大麥穗濕潤，最后放到冰箱中，在5℃下低溫預處理2-5天。
所述步驟（2）中的滅菌過程為：預處理后剪下大麥穗，將大麥穗浸泡于75%的酒精中處理3～5min，然后將該大麥穗轉移于超凈工作臺中剝離大麥穗，用消毒過的紗布包裹大麥穗后用濃度為0.1%的升汞滅菌10-12min并間或搖動，無菌水漂洗3～4次，打開紗布晾干。
所述步驟（3）中的大麥穗按照3.0-3.4mm/段進行機械分割。
所述步驟（3）中切碎的大麥穗倒入含有60-80ml的17%蔗糖溶液的100毫升離心管中，蓋上離心管蓋并用保鮮膜將離心管蓋子位置緊緊封閉。
所述步驟（3）中密封的離心管從超凈工作臺中取出后置于搖床上進行300-400rpm震蕩8-10min。
所述步驟（4）中的離心機參數設置為：離心機轉速10000-12000rpm，離心時間8-10分鐘，離心溫度15-25℃；所述的離體花藥需要放回超凈工作臺，無菌操作倒入盛有已滅菌的17%蔗糖溶液容器。
所述步驟（5）中的離體花藥接種和誘導培養過程為：用滅菌過的網篩勺攪動裝有離體花藥的蔗糖溶液，使離體花藥均勻分散，然后舀出，使得離體花藥均勻分散到網篩勺上，控出液滴，將離體花藥磕到裝有誘導培養基的培養瓶內，溫度為28-29℃、濕度70%左右的環境下暗培養，誘導出愈傷組織。
所述步驟（6）中的分化、繼代與移栽過程為：待花藥愈傷組織直徑達到1.5cm后，轉接于分化培養基，在溫度28～30℃、光14h/暗10h的條件下培養，獲得花培幼苗，待花培苗苗高達到5cm后轉接于生根培養基進行繼代培養，待花培苗長至10cm后移栽至周轉箱壯苗，10～15天后移栽入大田。
所述步驟（5）中的網篩勺的孔徑為40-48目。
本發明相比現有技術有如下優點：
本發明通過創造性地對大麥花藥采取機械切割的方式進行破碎，然后根據具體需要采用不同大小的離心力對碎片進行分離，成功提取到了純凈的大麥花藥，并通過優化離心介質和采用無菌操作，成功獲取到了活力旺盛的大麥花藥并進一步花培成功，獲得了健壯的花培苗；提高操作量的同時大大提升了花培工作效率。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
本發明提供的基于機械法獲取花藥的大麥花培方法的詳細技術方案為：
一種基于機械法獲取花藥的大麥花培方法，其特征在于：所述花培方法的步驟如下：
（1）取穗及預處理：
以采集主莖上的圓錐花序且其花藥中的小孢子處于單核晚期為標準取穗；取回來后先用75%乙醇表面消毒，然后用濕潤的紗布包裹整個大麥穗，保持大麥穗濕潤，最后放到冰箱中，在5℃下低溫預處理2-5天；
（2）對預處理后的大麥穗進行滅菌：
預處理后剪下大麥穗，將大麥穗浸泡于75%的酒精中處理3～5min，然后將該大麥穗轉移于超凈工作臺中剝離大麥穗，用消毒過的紗布包裹大麥穗后用濃度為0.1%的升汞滅菌10-12min并間或搖動，無菌水漂洗3～4次，打開紗布晾干；
（3）在無菌條件下將大麥穗進行機械分割，切碎的大麥穗倒入離心管中密封后置于搖床上震蕩：
在無菌條件下將大麥穗按照3.0-3.4mm/段進行機械分割，切碎的大麥穗倒入含有60-80ml的17%蔗糖溶液的100毫升離心管中，蓋上離心管蓋并用保鮮膜將離心管蓋子位置緊緊封閉，然后將密封的離心管從超凈工作臺中取出后置于搖床上進行300-400rpm震蕩8-10min；
（4）將初步震蕩后的離心管放入高速冷凍離心機中離心獲得離體花藥：
將初步震蕩后的離心管放入高速冷凍離心機中，離心機參數設置為：離心機轉速10000-12000rpm，離心時間8-10分鐘，離心溫度15-25℃離心，離心完成后將含離體花藥的離心管放回超凈工作臺，將花藥無菌操作倒入盛有已滅菌的17%蔗糖溶液容器；
（5）對離體花藥進行接種和誘導培養出花藥愈傷組織：
用滅菌過的孔徑為40-48目的網篩勺攪動裝有離體花藥的蔗糖溶液，使離體花藥均勻分散，然后舀出，使得離體花藥均勻分散到網篩勺上，控出液滴，將離體花藥磕到裝有誘導培養基的培養瓶內，溫度為28-29℃、濕度70%左右的環境下暗培養，誘導出愈傷組織；
（6）分化、繼代與移栽，完成該花培過程：
待花藥愈傷組織直徑達到1.5cm后，轉接于分化培養基，在溫度28～30℃、光14h/暗10h的條件下培養，獲得花培幼苗，待花培苗苗高達到5cm后轉接于生根培養基進行繼代培養，待花培苗長至10cm后移栽至周轉箱壯苗，10～15天后移栽入大田。
實驗驗證
為說明本發明的基于機械法獲取花藥的大麥花培方法中所采用的蔗糖等滲液濃度、最適離心力是符合花藥分離需求的。現進行以下實驗驗證以說明本發明的花培方法的創造性和實用性。
實驗一 蔗糖等滲液濃度的選擇
為使分離用的蔗糖溶液濃度接近大麥花藥的滲透壓，防止花藥吸水膨脹或失水萎焉，維持花藥內花粉生命力，我們測試了對花粉細胞等滲的蔗糖溶液濃度，采用不同濃度的蔗糖溶液浸泡分離的花粉，浸泡時間均為5小時，觀察花粉細胞的質壁分離現象，結果如下表一。
根據表一實驗結果，由于花粉細胞外有細胞壁，無法觀察到吸水現象，然而17%濃度的蔗糖溶液是花粉細胞不失水的最大濃度，因此我們推斷17%的蔗糖溶液最接近花粉細胞的滲透壓，又由于蔗糖對花藥無損傷，而且分離后的花藥亦需接種到高濃度的蔗糖培養基上誘導培養，因此選擇17%濃度的蔗糖溶液作為花藥離心的介質溶液，不會造成花粉細胞失水或吸水，能夠有效維持花粉細胞的生命力。
實驗二 花藥離心分離的最適離心力的選擇
由于不同的大麥組織器官由于密度大小不同，具有不同的沉降系數；為尋找出能有效分離大麥花藥所需的最適離心力，我們將3.0-3.4mm/段機械分割后的碎大麥穗加入17%蔗糖溶液后置于搖床上300-400rpm震蕩8-10min，然后采用不同轉速的離心力進行離心分離（20℃，8min），觀測離心結果，如表二。
由表二可以發現，采用10000-12000rpm轉速離心能有效分離出破碎大麥穗中的穎殼和支梗雜質，從大麥穗碎片中離心分離出純凈的大麥花藥，對機械分割后的大麥穗碎片10000rpm 8min離心后，能夠清晰的發現大麥花藥被分離出來。
對比例
為說明本發明提供的基于機械法獲取大麥花藥的花培方法的創造性，現將本發明獲得的大麥花藥和常規抖藥法分離的大麥花藥進行同樣的誘導培養，比較二者誘導率差異，結果如表三。
由表三可以發現，本發明提供的技術分離的花藥愈傷誘導率與常規分離的花藥愈傷誘導率并無顯著性差異，因此能夠說明，采用本發明分離花藥能夠較好的維持分離花藥的生命力，適用于進一步接種培養之用。將采用本技術路線分離出的大麥花藥進行誘導培養出優良的花藥愈傷組織，進一步分化培養，能夠分化出生長旺盛的花培幼苗。
本發明通過創造性地對大麥花藥采取機械切割的方式進行破碎，然后根據具體需要采用不同大小的離心力對碎片進行分離，成功提取到了純凈的大麥花藥，并通過優化離心介質和采用無菌操作，成功獲取到了活力旺盛的大麥花藥并進一步花培成功，獲得了健壯的花培苗；提高操作量的同時大大提升了花培工作效率。
以上實施例僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護范圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明保護范圍之內；本發明未涉及的技術均可通過現有技術加以實現。