本發明屬于作物雜種優勢利用的遺傳育種學領域，具體涉及利用長雄野生稻(Oryza longistaminata)無性繁殖特性培育多年生雜交稻的方法及其在雜種優勢固定中的應用。
背景技術：
雜種優勢現象普遍存在于整個生物界，而雜種優勢也被廣泛利用于農業、林業、畜牧業等方面，雜交稻的利用大大提高了我國水稻產量，被譽為是第二次綠色科技革命。生產實踐證明，在相同條件下，雜交水稻一般比普通良種增產20％左右。解決雜交水稻制種問題的有效途徑首推利用雄性不孕性，雄性不孕性在遺傳上一般分核質型和胞質型兩類，以后者在雜交優勢育種中最有利用價值。對于水稻雄性不孕植株，當用某一父本類型與之多次重復雜交，后代仍能保持雄性不孕；而在自由傳粉的某些情況下，則產生孕性分離的后代。因而在自由傳粉的情況下，不同父本核因子與不孕母本細胞質相互作用的特異性，致使F1發生不同的孕性分離現象，通過進一步選育，從中獲得雄性不孕系，保持系及恢復系，可用作水稻雜種優勢育種的材料。1987年，袁隆平院士提出雜交水稻育種分三個發展階段的戰略:育種方法從三系法到兩系法再到一系法，朝著程序由繁到簡而效率越來越高的方向發展。
雖然雜交稻技術對糧食安全具有顯著貢獻，但由于雜交稻種子只能利用一次，導致生產成本提高。如何利用長雄野生稻以多年生性為主的無性繁殖特性培育多年生雜交稻從而實現雜交稻種植一次收獲多年(多次)，達到固定雜種優勢、降低稻作生產成本、提高稻作生產效益的目的，成為農業科技人員亟待解決的問題。
技術實現要素：
本發明提供了利用長雄野生稻無性繁殖特性固定雜種優勢的方法，培育多年生雜交稻，實現雜交稻種植一次能夠收獲多年(多次)的稻作生產方式，進而固定雜種優勢、降低稻作生產成本、提高稻作生產效益。
本發明通過以下技術方案予以實現：
利用長雄野生稻無性繁殖特性固定雜種優勢的方法，包括如下步驟：
(I)培育攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻不育系；
(II)培育攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻恢復系；
(III)利用多年生稻不育系和恢復系、或不育系和多年生稻恢復系、或多年生稻不育系和多年生稻恢復系進行測配，篩選并培育具有多年生性的多年生雜交稻。
在本發明的一個方面，步驟(I)中所述的多年生稻不育系包括多年生稻三系不育系和多年生稻兩系不育系。
在本發明的一個方面，步驟(I)培育攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻三系不育系包括以下步驟：
(I-1)以長雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進行雜交獲得第一F1代；
(I-2)將所述第一F1代自交，得到第一F2代；
(I-3)篩選出攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代，其中多年生性遺傳位點包括主效位點和微效位點；
(I-4)攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代連續自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，所述多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點，即具有多年生性狀；
(I-5)利用步驟(I-4)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以與三系雜交稻不育系對應的保持系做母本，通過雜交將多年生性遺傳位點導入至保持系中，獲得第二F1代；
(I-6)所述第二F1代與所述保持系做父本進行回交，再自交，篩選出攜帶多年生性遺傳位點的多年生稻保持系；
(I-7)所述三系雜交稻多年生稻保持系與其相應的三系雜交稻不育系雜交，培育得到攜帶多年生性遺傳位點的多年生稻不育系。
在本發明的一個方面，步驟(I)培育攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻兩系不育系包括以下步驟：
(I’-1)以長雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進行雜交獲得第一F1代；
(I’-2)將所述第一F1代自交，得到第一F2代；
(I’-3)篩選出攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代，其中所述多年生性遺傳位點包括主效位點和微效位點；
(I’-4)攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代連續自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，所述多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點，即具有多年生性狀；
(I’-5)利用步驟(I’-4)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以兩系雜交稻不育系做母本，通過雜交將多年生性遺傳位點導入至兩系雜交稻不育系中，獲得第三F1代；
(I’-6)所述第三F1代與所述兩系雜交稻不育系做父本在可育環境條件下進行回交，再自交自交，篩選出攜帶多年生性遺傳位點的多年生兩系雜交稻不育系，所述可育環境條件包括溫度和/或日照長度條件。
在本發明的一個方面，步驟(II)培育攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻恢復系包括以下步驟：
(II-1)以長雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進行雜交獲得第一F1代；
(II-2)將第一F1代自交，得到第一F2代；
(II-3)篩選出攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代，其中多年生性遺傳位點包括主效位點和微效位點；
(II-4)攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代連續自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點，即具有多年生性狀；
(II-5)利用步驟(II-4)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以恢復系做母本，通過雜交將多年生性遺傳位點導入至恢復系中，獲得第四F1代；
(II-6)第四F1代與恢復系做父本進行回交，再自交，篩選出攜帶多年生性遺傳位點的多年生稻恢復系。
在本發明的一個方面，栽培稻是RD23。
在本發明的一個方面，主效位點包括Rhz2和Rhz3，微效位點包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。
在本發明的一個方面，具有多年生性狀的多年生稻品系攜帶選自Rhz2、Rhz3、QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10的一個或多個多年生性遺傳位點。
在本發明的一個方面，第一F2代連續自交得到的后代材料包括F3代、F4代、F5代、F6代、F7代、F8代、F9代、F10代、F11代和/或F12代中的一種或多種。
本發明還提供了利用長雄野生稻無性繁殖特性固定稻作雜種優勢的方法在選育多年生雜交稻及其在雜種優勢固定中的應用。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面結合具體實施方式，對本發明進一步詳細說明。應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知結構和技術的描述，以避免不必要地混淆本發明的概念。
在本發明中，用作父本的是長雄野生稻(Oryza longisatminata)，其為廣泛生長在熱帶非洲的一個野生種，具有長柱頭和花藥(Oka，1967)、自交不親和(Nayar，1968；Chu，1969)、異花授粉(Causse，1991)和地下莖(Porteres，1949；Bezancon，1977；Ghesquiere，1985)特性。在長雄野生稻中，由于地下莖的無性繁殖作用，是發展多年生稻的理想性狀，本 發明正是基于長雄野生稻的該特性成功培育成多年生稻不育系和/或多年生稻恢復系。
在本發明中用作母本的栽培稻可以是包括秈稻和粳稻在內的多數水稻品種，在優選的實施方式中，栽培稻是RD23，其為來自泰國的廣泛種植的秈稻品種。
在本文中，術語“多年生”，“多年生性”或相似術語是指通過長雄野生稻與栽培稻雜交后代選育的具有種植一次通過無性繁殖可以生長并收獲多年(2年及以上)的品系特性，從而具有良好的越冬能力。
采用本領域技術人員所熟知的技術，例如但不限于雜交，回交和分子標記輔助選擇技術(MAS)，以長雄野生稻為父本，栽培稻為母本獲得第一F1代，在優選的實施方式中，第一F1代是F1(RD23/O.longistaminata)。
在本文中，術語“自交”是指來自同一個體的雌雄配子的結合或具有相同基因型個體間的交配或來自同一無性繁殖系的個體間的交配。
在本文中，術語“回交”指子一代與兩個親本中的任意一親本進行雜交，這種方法叫做回交。在育種工作中，常利用回交的方法來加強雜種個體中某一親本的性狀表現。用回交方法所產生的后代稱為回交雜種。被用來回交的親本稱為輪回親本，未被用來回交的親本稱為非輪回親本。
在本發明中，通過對第一F1代進行自交，得到第一F2代。在本發明中，還可以包括通過對第一F1代進行回交，得到BC1(輪回親本為母本栽培稻，在優選的實施方式中優選為母本栽培稻RD23)分離群體。
對第一F2代和/或BC1分離群體進行遺傳分析，篩選出多年生性遺傳位點，對長雄野生稻的多年生性遺傳位點的鑒定和分析可以參見胡鳳益所著“長雄野生稻地下莖分子定位和遺傳研究”，西南農業大學2002屆碩士論文。在本發明中全文引入該論文作為參考文獻。其中多年生性遺傳位點包括主效位點和微效位點，具體而言：
在本發明中，主效位點包括Rhz2和Rhz3，Rhz2和Rhz3分別定位在第3染色體上的SSR分子標記OSR16和OSR13之間，其距離分別是1.3cM 和8.1cM，和第4染色體上的SSR分子標記RM119和RM237之間，其距離分別是2.2cM和7.4cM，須說明的是，OSR16等標記名稱是本領域技術人員應該都知曉的，屬于基于水稻基因組序列公開發布的水稻SSR分子標記術語。
如表1所示，在本發明中，微效位點包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。
在本發明中所使用的，Rhz代表地下莖表達主效位點；Q代表微效位點(QTL)；RN:單株地下莖多少；RBD：地下莖分枝程度；RBN：二次分枝程度；RL:地下莖平均長度；RIL:地下莖節間的平均長度；RIN：地下莖節間數；RDW：單株地下莖干重；TN：單株分蘗數；數字代表該位點位于第幾號染色體。
表1地下莖相關基因/QTLs及性狀
在本發明中，將攜帶多年生性遺傳位點的第一F2代自交獲得包括F3代、F4代、F5代、F6代、F7代、F8代、F9代、F10代、F11代和/或F12代中的一種或多種后代材料，基因組基本穩定純合形成株系，從而可以用作攜帶多年生性遺傳位點的第一多年生稻品系，其中第一多年生稻品系根據品系基因型(攜帶不同多年生遺傳位點)和表現型的不同可以包括一種或多種品系，可以根據需要選擇任一種多年生稻品系進行育種。在本發明中優選使用的第一多年生稻品系是采用分子標記輔助選擇培育的具有多年生性狀的品系，如本發明中的PR23、PR24等品系，即多年生稻23號，多年生稻24號，根據英文Perennial Rice 23，Perennial Rice 24命名，在優選的實施方式中，不同品系攜帶不同遺傳位點并打破了地下莖(即無性繁殖特性或多年生性)與不育基因的連鎖。此處的地下莖與不育基因的連鎖是指由于長雄野生稻存在不育基因或半不育基因以及具有自交不親和基因，而不育性狀與地下莖性狀存在一定的連鎖關系，所以要選擇帶有地下莖(多年生性)的植株，通常也是不育的，只有打破它們基因之間的連鎖，才能真正用于育種，獲得多年生稻，保證產量，例如PR24攜帶了多年生性遺傳位點Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)，可以實現多年生性。
在本發明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點的多年生稻品系為供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，以與三系雜交稻不育系對應的三系雜交稻保持系做母本，通過雜交方法將多年 生性遺傳位點導入至三系雜交稻保持系中，再轉至不育系中。
在本發明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點的多年生稻品系為供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，以與兩系雜交稻不育系做母本，通過雜交方法將多年生性遺傳位點導入至兩系雜交稻不育系中。
在本發明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點的多年生稻品系為供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，以恢復系做母本，通過雜交方法將多年生性遺傳位點導入至恢復系中。
目前本領域中研究及生產常用的不育系，例如野敗型雄性不育系、秈型雄性不育系培矮64S，包括三系配套、兩系配套中的不育系均可以用于本發明，保持系與不育系是對應關系(三系配套)或兩系合一(光溫敏型不育系)(兩系配套)；恢復系是與不育系雜交，可以恢復不育系育性并且F1代植株具有顯著雜種優勢的品系(種)。
在本發明中可以使用的三系雜交稻包括本領域中已知的三系水稻，例如不育系(如珍汕97A)、保持系(珍汕97B)、恢復系(蜀恢527)，本發明中優選使用的是云南大學提供的三系水稻，即不育系芽1A、保持系芽1B和恢復系R2066。
在本發明中可以使用的兩系雜交稻包括本領域中已知的兩系水稻，例如光溫敏核不育系培矮64S、恢復系9311，本發明中優選使用的是華中農業大學提供的兩系水稻不育系，即光溫敏核不育系華1015S。
在本發明中采用MAS技術，MAS技術即分子標記輔助選擇(MolecularMarker-Assisted Selection MAS)是利用與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記進行間接選擇，是對目標性狀在DNA水平的選擇，不受環境影響，不受等位基因顯隱性關系干擾，選擇結果可靠，同時又可避免等位基因間顯隱性關系的干擾，從而達到作物產量、品質和抗性等綜合性狀的高效改良；分子標記輔助選擇育種具有標記基因型鑒定可以在低世代和植株生長的任何階段進行、共顯性的分子標記允許在雜合體階段進行鑒定隱性基因、 對目的基因的選擇不受基因表達和環境條件的影響等優點。分子標記輔助選擇育種是將分子標記應用于作物改良的一種手段，其基本原理是利用與目標基因緊密連鎖或表現共分離的分子標記對選擇個體進行目標以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個體，達到提高育種效率的目的。
MAS根據分子標記的不同，如常用的有SSR標記、SNP標記、CAPS標記等，但原理和步驟基本相同，雖然操作方式會有差異，在本領域中有大量的相關文章和書籍，在育種領域已經成為很常用的技術，為本領域技術人員所熟知。基本步驟包括DNA提取、PCR標記的擴增、凝膠電泳、和/或結果(帶型)分析。
本發明參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對各株系的代表單株分別提取基因組DNA。
對多年生性遺傳位點緊密連鎖多態的SSR標記進行各單株基因組DNA為模板的聚合酶鏈式反應(PCR)。
PCR反應的產物通過8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進行分離，銀染后，參考雙親的擴增條帶，對帶型進行判別記錄，篩選目的基因型單株。
在本發明中，用多年生稻品系做供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，三系雜交稻保持系做受體獲得的第二F1代，在優選實施方式中，第二F1代是F1(三系雜交稻保持系/PR24)。第二F1代與三系雜交稻保持系母本進行回交和/或自交，每代都通過相應遺傳位點緊密連鎖分子標記(SSR標記，表1)進行遺傳位點的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的三系雜交稻多年生保持系。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用MAS留下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發明中第二F1代與三系雜交稻保持系母本進行回交和/或自交的先后順序以及重復次數沒有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的第一多年生保持系。其中，在優選的實施方式中，進行回交1次，或者連續回交2次、3次、4次或更多次；在優選的實施方式中，進行自交1次，或者連續自交2次、3次、4 次或更多次。在優選的實施方式中，單次或連續的回交和單次或連續的自交可以交替進行。
在本發明中，遺傳位點的追蹤與鑒定是MAS過程，從而獲得帶有長雄野生稻多年生性(無性繁殖特性)遺傳位點的單株。
將三系雜交稻多年生保持系與其相應的三系雜交稻不育系雜交，培育得到攜帶多年生性遺傳位點的多年生稻不育系。
在本發明中，用多年生稻品系做供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，兩系雜交稻不育系做受體獲得的第三F1代，在優選實施方式中，第三F1代是F1(兩系雜交稻不育系/PR24)。第三F1代與兩系雜交稻不育系母本在可育環境條件下進行回交和/或自交，每代都通過相應遺傳位點緊密連鎖分子標記(SSR標記進行回交和/或自交，每代都通過相應遺傳位點緊密連鎖分子標記(SSR標記，表1)進行遺傳位點的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的兩系雜交稻多年生稻不育系，可育環境條件包括溫度、日照長度等條件。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用MAS留下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發明中第三F1代與兩系雜交稻不育系對應可育期植株母本進行回交和/或自交的先后順序以及重復次數沒有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的兩系雜交稻多年生稻不育系。其中，在優選的實施方式中，進行回交1次，或者連續回交2次、3次、4次或更多次；在優選的實施方式中，進行自交1次，或者連續自交2次、3次、4次或更多次。在優選的實施方式中，單次或連續的回交和單次或連續的自交可以交替進行。
在本發明中，用多年生稻品系做供體，在優選實施方式中以PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，恢復系做受體獲得的第四F1代，在優選實施方式中，第四F1代是F1(恢復系/PR24)。第四F1代與恢復系母本進行回交和/或自交，每代都通過相應遺傳位點緊密連鎖分子標記(SSR標記，表1)進行遺傳位點的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻恢復系。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用MAS留 下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發明中第四F1代與恢復系母本進行回交和/或自交的先后順序以及重復次數沒有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點的多年生稻恢復系。其中，在優選的實施方式中，進行回交1次，或者連續回交2次、3次、4次或更多次；在優選的實施方式中，進行自交1次，或者連續自交2次、3次、4次或更多次。在優選的實施方式中，單次或連續的回交和單次或連續的自交可以交替進行。
在本發明中，遺傳位點的追蹤與鑒定是MAS過程，從而獲得帶有長雄野生稻多年生性(無性繁殖特性)遺傳位點的單株。
在本發明中，培育通過以下三種方式得到多年生雜交稻組合：
方式一：以恢復系為父本，與本發明的多年生稻不育系進行雜交測配，獲得多年生雜交稻組合。
方式二：以本發明的多年生稻恢復系為父本，與不育系雜交測配，獲得多年生雜交稻組合。
方式三：以本發明的多年生稻恢復系為父本，與本發明的多年生稻不育系雜交測配，獲得多年生雜交稻組合。
本文中使用的術語“雜交測配”是指雜交水稻配組測交獲得雜交種子，是雜交育種的前提，可用來測定親本配合力和恢復系對不育系的育性恢復能力，是用來評定一個親本材料在雜種優勢利用或雜交育種中的利用價值的試驗方式，進行測配的步驟為本領域技術人員所熟知。
本發明通過在不育系和/或恢復系中引入長雄野生稻中控制無性繁殖特性(多年生性)的遺傳位點，培育多年生雜交稻，實現了雜交稻種植一次可連續收獲多年(多次)的稻作生產方式，達到了利用長雄野生稻無性繁殖特性固定稻作雜種優勢的目的，降低了稻作生產成本，提高了稻作生產效益。
本發明提供的方法可以指導其他作物雜種優勢固定(例如玉米、小麥等作物)，對保障糧食安全及保持生態安全具有十分重要的戰略意義。
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本 發明的實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例
實驗材料與方法
實驗材料包括以下
長雄野生稻：從尼日爾收集，由日本物理與化學研究所的HiroshiHyakutake博士友好提供；
栽培稻RD23：來自泰國廣泛種植的秈稻品種；
三系雜交稻不育系芽1A：由云南大學提供；
三系雜交稻保持系芽1B：由云南大學提供；
兩系雜交稻不育系1015S:由華中農業大學提供；
恢復系R2066：由云南大學提供。
雜交方法在本領域中廣泛已知，完全在本領域技術人員的能力范圍之內，具體可以參考《作物育種學》—中國農業大學出版社。
分子標記輔助選擇(MAS)及多年生性遺傳位點的分子標記檢測參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對各株系的代表單株分別提取基因組DNA。對多年生性遺傳位點緊密連鎖多態的SSR標記進行各單株基因組DNA為模板的聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR反應的產物通過8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進行分離，銀染后，參考雙親的擴增條帶，對帶型進行判別記錄，篩選目的基因型單株。
本案例所涉及材料與方法，如無特殊說明，均為常規材料與方法。
實施例1F1(RD23/O.longistaminata)代的培育
以RD23為母本去雄后，長雄野生稻為父本直接授粉后通過幼胚挽救獲得到F1(RD23/O.longistaminata)植株，其開花時期表現出花藥不開裂，具有約30％左右的花粉育性、地下莖表現介于父本和母本之間。
實施例2多年生稻品系PR24的培育
種植實施例1中所獲得的F1(RD23/O.longistaminata)代，通過對F1植株進行強制自交授粉獲得了F2代種子,這些種子用1/4MS培養基(3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH值5.8)進行胚培養獲得株苗，通過練苗后移栽種植，最終獲得分離的F2單株進行篩選。
利用選自Rhz2和Rhz3中的一個或多個主效位點，選自QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10中的一個或多個微效位點對分離的F2單株進行篩選，選育出多年生稻品系PR24(Perennial Rice 24,PR24)，經分子檢測，該品系攜帶了來自長雄野生稻多年生性遺傳位點Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)(表2),經過水稻生產實踐證實，其產量表現穩定，農藝性狀優良，具有很好的多年生性。
表2列出了在實施例中所使用的品系的基因型。
表2所用品系基因型列表
注：A為母本帶型，B為父本帶型，H為雜合帶型,Rhz代表地下莖表達主效位點；Q代表微效位點(QTL)；Rn代表單株地下莖個數多少；Rbd：地下莖分枝程度；Rl:地下莖平均長度；數字代表該位點位于第幾號染色體。
實施例3多年生稻不育系(三系)的培育
以三系雜交稻保持系芽1B為母本進行人工去雄，以多年生稻PR24為父本進行雜交獲得F1(三系雜交稻保持系(芽1B)/PR24)代。
用F1(三系雜交稻保持系(芽1B)/PR24)代和三系雜交稻保持系1B進行回交4次，然后連續自交4次。在回交和自交過程中利用基于SSR的分子標記輔助選擇(Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)育種技術，對多年生性位點Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)進行檢測，選擇攜帶這些位點的植株進行進一步的回交、自交，直至純合穩定，獲得多年生稻保持系，命名為Perennial Rice芽1B，即PR芽1B(表2)。
用三系雜交稻多年生稻保持系PR芽1B與相應的三系雜交稻不育系芽1A進行雜交，對產生的F1植株進行花粉育性鑒定及自交結實率考查，以檢測其對不育性的保持能力，標準為花粉育性與不育系芽1A一致，而自交結實率為零。
在上述檢測過程中，利用MAS篩選連續多代選擇攜帶來自長雄野生稻的多年生性遺傳位點和花粉完全敗育的單株，最終獲得具有多年生稻不育系，命名為PR芽1A(表2)。
實施例4多年生稻不育系(三系)田間評價
將三系雜交稻多年生稻不育系PR芽1A、三系雜交稻多年生稻保持系PR芽1B在景洪試驗田進行多年生性、育性評價，供體多年生稻PR24和受體三系雜交稻不育系芽1A、三系雜交稻保持系芽1B作為對照在景洪試驗田進行同田種植，經過2年4季的田間試驗，結果如下表(表4)所示：
表3多年生稻不育系(三系)田間評價結果
注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻。
由上表可知：多年生稻不育系可以實現多年生，實現通過無性繁殖方式保存和繁殖多年生稻不育系。
實施例5多年生稻不育系(兩系)的培育
以水稻光溫敏核不育系-華1015S為母本進行人工去雄，以多年生稻PR24為父本進行雜交獲得F1(華1015S/PR24)代。
用F1(華1015S/PR24)代和華1015S進行回交4次，然后連續自交4次。在回交和自交過程中利用基于SSR的分子標記輔助選擇(MolecularMarker-Assisted Selection，MAS)育種技術，對多年生性位點Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)進行檢測，選擇攜帶這些位點的植株進行進一步的回交、自交，直至純合穩定，獲得多年生稻不育系，命名為Perennial Rice華1015S，即PR華1015S(表2)。
注：以上試驗在保山市施甸縣試驗田進行(華1015S在保山市低溫環境下可育，在景洪表現不育特性)；光溫敏核不育系如華1015S是秈型光溫敏核不育系，育性主要受溫度影響，即具有在低溫(<23℃)可育，在高溫條件下不育特性，因此，低溫下其正常可育自交結實，可以進行種質材料繁種和保存，達到了不育系和保持系兩系合一的目的，加上恢復系即 組成了兩系雜交稻。
實施例6多年生稻不育系(兩系)田間評價
將兩系雜交稻多年生稻不育系PR華1015S在景洪和保山市施甸縣試驗田進行多年生性、育性評價，供體多年生稻PR24和受體華1015S作為對照進行同田種植，經過2年4季的田間試驗，結果如下表(表4)所示：
表4多年生稻不育系(兩系)田間評價結果
注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻。
由上表可知：多年生稻不育系可以實現多年生，實現通過無性繁殖方式保存保存和繁殖多年生稻不育系。
實施例7多年生稻恢復系的培育
以雜交稻恢復系R2066為母本進行人工去雄，以多年生稻PR24為父本進行雜交獲得F1(恢復系R2066/PR24)代。
用F1(恢復系R2066/PR24)代和恢復系R2066進行回交4次，然后連續自交4次。在回交和自交過程中利用基于SSR的分子標記輔助選擇(Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)育種技術，對多年生性位點Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)進行檢測，選擇攜帶這些位點的植株進行進一步的回交、自交，直至純合穩定，獲得多年生稻恢復系，命名為Perennial Rice R2066，即PRR2066(表2)。
實施例8多年生稻恢復系田間評價
(1)多年生稻恢復系與不育系雜交試驗
將多年生稻恢復系PRR2066與三系雜交稻不育系芽1A進行田間雜交制種，結果顯示，PRR2066可以恢復三系雜交稻不育系芽1A的育性獲得雜交種。
(2)多年生稻恢復系多年生性試驗
將多年生恢復系PRR2066在景洪試驗田進行多年生性評價和雜交稻制種試驗，供體多年生稻PR24作為對照在景洪試驗田進行同田種植，經過2年4季的田間試驗，結果如下表(表5)所示：
表5多年生稻恢復系多年生性試驗結果
注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻
由上述結果可知：1.多年生稻恢復系PRR2066可以恢復不育系芽1A的育性；2.多年生稻恢復系PRR2066可以實現多年生性。
實施例9多年生雜交稻的培育
方式一：以雜交稻恢復系R2066為父本，與實施例3的多年生稻不育系PR芽1A進行雜交測配，獲得多年生雜交稻組合PR芽R2066-1。
方式二：以實施例7的多年生稻恢復系PRR2066為父本，與不育系芽1A雜交測配，獲得多年生雜交稻組合PR芽R2066-2。
方式三：以實施例7的多年生稻恢復系PRR2066為父本，與實施例3的多年生稻不育系PR芽1A雜交測配，獲得多年生雜交稻組合PR芽R2066-3。
實施例10多年生雜交稻生產評價
將多年生雜交組合在景洪試驗田進行多年生性、雜種優勢評價，供體多年生稻PR24和恢復系作為對照在景洪試驗田進行同田種植，經過2年4季的田間試驗，結果如下表(表6)所示：
表6多年生雜交稻田間試驗評價結果
注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻
由上表可知：1.多年生雜交稻可以實現種植一次通過無性繁殖可以連續收獲2年共4次，具有多年生性；2.多年生雜交稻，在不同年份相同季節產量相當，固定了雜種優勢。由此可見，多年生雜交稻可以實現種植一次通過無性繁殖連續多年(多季)生產，達到利用長雄野生稻無性繁殖特性固定雜種優勢的目的。
應當理解的是，本發明的上述具體實施方式僅僅用于示例性說明或解釋本發明的原理，而不構成對本發明的限制。因此，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。此外，本發明所附權利要求旨在涵蓋落入所附權利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內的全部變化和修改例。