本發明屬于水產養殖技術領域，具體的涉及一種仿刺參性別及性腺成熟度的鑒別方法。
背景技術：
仿刺參又稱刺參，是中國20多種食用海參中質量最好的一種，被列為"海產八珍"之一，在我國已得到廣泛的養殖。在刺參人工增養殖、良種繁育以及科學實驗過程中需要對刺參的雌雄性別及性腺成熟度進行鑒別。但是刺參雌雄在外觀上并無顯著差異，而且性腺成熟度從表觀無法識別，因而對刺參性別及性腺成熟度的鑒別是刺參人工繁育工作過程中的難點。在過去，對刺參性別只能采用解剖親體及親體排精排卵后才能鑒定，隨著刺參人工繁育技術的不斷發展，超聲波技術也應用到刺參性別鑒定中(申請號：201410142943.8)。由于刺參活體性別表觀鑒定困難，雌雄難以分辨，在進行刺參人工繁育時，需要培養和促熟大量的親體以保證繁育效果，若雄多，則受精卵少、畸形率高，且需要對受精卵進行人工清洗；若雌多，則受精率低，降低出苗率，這些都大大的增加人工促熟過程中的勞動量和生產成本。同時性腺成熟度難以判定，而利用解剖親體的方法對刺參的性腺成熟度進行觀察，增加了刺參人工繁育過程中的經濟損失。因而尋求一種刺參性別準確實用的鑒別方法對降低刺參人工繁育過程中的生產成本有重要的意義。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題在于提供一種仿刺參性別及性腺成熟度的鑒別方法，本發明采用負壓式組織采集器獲得麻醉后刺參的部分性腺組織，根據刺參雌雄性腺的顏色及其中生殖細胞的種類、大小、數量及結構特征對刺參的性別及性腺成熟度進行鑒定。利用該方法對刺參的性別及性腺成熟度進行鑒定，創傷小，無需解剖刺參親體，減少親體損耗及經濟損失。
本發明是按照以下操作技術完成的：
一種負壓式組織采集器，它包括推桿、活塞、筒體、固定套、采集管、外套管和采集管保護套；其中推桿和活塞相連，置于筒體內，采集管為側吸式，采集管一端尖銳，采集管尖銳端一側開有小孔，小孔下邊緣為鋒利的刀片結構；采集管通過固定套與筒體底部相連，采集管尖銳端遠離筒體，外套管包繞于采集管外側，且外套管能夠沿采集管上下滑動，采集管保護套位于外套管外側，保護采集管免受外力損傷。
進一步，所述負壓式組織采集器所用采集管規格為：外徑0.81mm，內徑0.5mm，長度60mm。
一種仿刺參性別及性腺成熟度的鑒別方法，包括仿刺參麻醉、仿刺參性腺組織采集及仿刺參復蘇三個步驟；
所述仿刺參麻醉：用潔凈海水配置20g/l MgCl2溶液，將待檢測的仿刺參放入含有海水的水槽中，使海水沒過刺參，然后向水槽中不斷加入配置好的20g/l MgCl2溶液，使MgCl2溶液終濃度為10g/l，加入過程中不斷緩慢攪拌，使MgCl2溶液均勻分布，麻醉時間為30min～1h，至仿刺參觸手與身體自然舒展，對外界刺激無反應；
所述組織采集方法：利用所述的負壓式組織采集器進行采集，取下負壓式組織采集器的采集管保護套，從仿刺參性腺生殖孔后方2-3cm處背側向肛門端進行采集，采集管緊貼仿刺參體壁內側，向外抽動推桿1-2cm，使筒體內產生負壓，待性腺組織吸入采集管內腔后，向下推動外套管，使體內組織與采集管內腔組織分離；將采集管和外套管抽出，將采集的性腺組織置于載玻片上進行顯微觀察；
所述仿刺參復蘇：將抽樣后的仿刺參放入潔凈的海水中暫養，直至仿刺參復蘇并自由活動。
進一步，所用負壓式組織采集器采集組織時，小孔向下，采集管緊貼刺參體壁內側。
進一步，性腺組織在負壓作用下進入采集管內腔后，需向下推動外套管，使外套管的下邊緣超過采集管小孔的下邊緣，所述的下邊緣是指靠近采集管的尖端側。
仿刺參雌雄性別特征為雌性性腺為淡黃色或橘紅色，隨性腺成熟度增加而逐漸加深，內部生殖細胞為卵原細胞和卵母細胞，成熟期可見成熟卵子。成熟期的雌性性腺為橘紅色，內部充滿卵母細胞并出現成熟卵子，卵母細胞直徑達90um以上，卵母細胞與生發泡輪廓清晰，生發泡大，占卵母細胞體積的30％-50％。雄性性腺內部生殖細胞為精原細胞、精母細胞和精子細胞，成熟期的雄性性腺為乳白色，內部充滿大量的精子。根據前人研究，刺參的性腺發育程度，可將刺參性腺成熟度分為四個時期：休止期、生長期、成熟期和排放期，根據每個時期的特征可對刺參的性腺成熟度做出判定。
本發明與現有技術相比的有益效果：
本發明方法通過切實觀察刺參的性腺的顏色及其中生殖細胞的種類、大小、數量及結構特征對刺參的性別及其性腺成熟度進行鑒定。采用此方法對刺參的性別及性腺成熟度進行鑒定達到微創，不用對刺參親體進行解剖，減少親體損耗，達到減少經濟損失的目的。用本方法對刺參性別及性腺成熟度進行鑒定，達到準確高效，技術易掌握，有刺參育苗經驗的技術工人即可進行鑒定，準確度可達100％。本發明可操作性良好，配備負壓式組織采集器，體積小，易攜帶，容易購買與，成本低，清洗消毒后可反復多次使用。
附圖說明
圖1為負壓式組織采集器的結構示意圖：1、推桿，2、活塞，3、筒體，4、固定套，5、采集管，6、外套管，7、采集管保護套，8、小孔。
具體實施方式
下面通過實施例詳細敘述本發明的技術方法：
實施例1：
負壓式組織采集器，如圖1所示，它包括推桿1、活塞2、筒體3、固定套4、采集管5、外套管6和采集管保護套7；其中推桿1和活塞2相連，置于筒體3內，采集管5為側吸式，采集管一端尖銳，采集管尖銳端一側開有小孔8，小孔下邊緣為鋒利的刀片結構；采集管5通過固定套4與筒體3底部相連，采集管尖銳端遠離筒體，外套管6包繞于采集管5外側，且外套管能夠沿采集管上下滑動，采集管保護套7位于外套管6外側，保護采集管5免受外力損傷。所用負壓式組織采集器的采集管規格對刺參性別鑒定的影響。
實驗采用25G4#(0.4mm*0.2mm*40mm，外徑*內徑*長度，下同)、23G6#(0.64mm*0.36mm*60mm)、21G8#(0.81mm*0.5mm*60mm)和19G10#(1.06mm*0.72mm*60mm)4種規格的采集管用本方法對120頭同一養殖池中已進行人工促熟的刺參(207±18g)的性別進行鑒定，每種規格采集管鑒定30頭，記錄鑒定結果，鑒定完畢后，解剖已鑒定刺參，驗證實驗結果，實驗結果見表1。
表1不同規格采集管對刺參性別鑒定的影響
根據實驗結果，經過反復實驗認證，利用本發明的方法對刺參雌雄性別進行鑒定最適采集管規格為外徑0.81mm，內徑0.5mm，準確率高達100％。
實施例2不同發育時期對刺參性別鑒定的影響
利用本發明方法(采集管規格外徑0.81mm，內徑0.5mm)，分別于2015年11月、2016年3月、5月及8月對威海、煙臺養殖池塘中的刺參(256±15g)性別進行鑒定，每個時間各取30頭親參。記錄鑒定結果，鑒定完畢后對刺參進行解剖，驗證實驗結果，實驗結果見表2。
表2不同發育時期對仿刺參性別鑒定的影響
根據實驗結果，經過反復認證，本發明方法對已發育仿刺參性腺的性別鑒定準確率高達100％。
實施例3不同采集位置對仿刺參雌雄性別鑒定的影響
利用本發明方法(采集管規格外徑0.81mm，內徑0.5mm)，分別從刺參性腺所在位置的背側前部、中部和后部三個位置對刺參的性別進行鑒定，所述的背側中部也即仿刺參性腺生殖孔后方2-3cm處背側向肛門端采集性腺，每個采集部位檢測刺參30頭，規格為236±27g，記錄實驗結果，鑒定結束后解剖仿刺參，對實驗結果進行認證，實驗結果見表3。
根據實驗結果，經過反復認證，利用本發明方法對仿刺參性別進行鑒定時從仿刺參性腺所在位置的背側中部采集能夠獲得較好的檢測效果，準確率高達100％。
表3不同采集位置對刺參性別鑒定的影響
實施例4
2016年4月在山東乳山某育苗廠進行仿刺參雌雄性別鑒定，步驟包括仿刺參麻醉、仿刺參性腺組織采集及仿刺參復蘇三個步驟；
所述仿刺參麻醉：用潔凈海水配置20g/l MgCl2溶液，將待檢測的仿刺參放入含有海水的水槽中，使海水沒過刺參，然后向水槽中不斷加入配置好的20g/l MgCl2溶液，使MgCl2溶液終濃度為10g/l，加入過程中不斷緩慢攪拌，使MgCl2溶液均勻分布，麻醉時間為30min，至仿刺參觸手與身體自然舒展，對外界刺激無反應；
所述組織采集方法：取下負壓式組織采集器的采集管保護套，從仿刺參性腺生殖孔后方2cm處背側向肛門端進行采集，采集管緊貼仿刺參體壁內側，向外抽動推桿1cm，使筒體內產生負壓，待性腺組織吸入采集管內腔后，向下推動外套管，使體內組織與采集管內腔組織分離；將采集管和外套管抽出，將采集的性腺組織置于載玻片上進行顯微觀察；
所述仿刺參復蘇：將抽樣后的仿刺參放入潔凈的海水中暫養，直至仿刺參復蘇并自由活動。
鑒定設備為滅菌的負壓式組織采集器，配備外徑0.81mm，內徑0.5mm的采集管，對濕重150g到300g的20頭刺參進行性別鑒定，采集位置為刺參性腺所在位置的背側中部，也即仿刺參性腺生殖孔后方2cm處背側向肛門端，顯微觀察并記錄刺參性別和性腺成熟度。對鑒定后的刺參進行解剖，驗證實驗結果，鑒定準確度高達100％。
實施例5
2016年4月在山東煙臺某育苗廠進行刺參雌雄性別鑒定，鑒定方法同實施例4，鑒定設備為滅菌的自制負壓式組織采集器，配備外徑0.81mm，內徑0.5mm的采集管，對已進行人工促熟的濕重為200g到300g的10頭刺參進行性別鑒定，采集位置為刺參性腺所在位置的背側中部，也即仿刺參性腺生殖孔后方2cm處背側向肛門端采集性腺，顯微觀察并記錄刺參性別和性腺成熟度。對鑒定后的刺參進行解剖，驗證鑒定結果，鑒定準確度高達100％。
實例結果顯示，選擇合適的采集管規格、合適的采集位置以及合適的性腺發育時期可對刺參的性別及性腺成熟度進行準確的鑒定，采用本發明方法對刺參性別及性腺成熟度進行鑒定方便，成本低，而且對刺參微創，不造成親參損失，準確高效，技術易掌握，可以廣泛的應用于刺參人工繁育中的性別及性腺成熟度鑒定。