本發明屬于動物卵母細胞及胚胎的冷凍保存
技術領域：
，特別是涉及一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液、冷凍保存方法和應用。
背景技術：
：卵母細胞冷凍保存是指將收集的卵母細胞在超低溫（-196℃液氮）條件下保存，使其代謝活動停止，處于休眠狀態，當外界環境達到適宜條件后又可以繼續授精發育成健康胚胎的一種保存技術。卵母細胞冷凍保存技術可以為建立優良品種卵母細胞庫或基因庫提供條件；使因疾病或其他原因丟失的各種動物品種、品系和珍惜瀕危動物得以保持；可以實現簡便廉價的遠距離運輸，方便國際間引種；它代替運輸活畜，節省大量時間和資金，還可以減少活畜運輸時傳播疾病的危險。卵母細胞冷凍保存首次成功是1977年whittingham冷凍成熟的小鼠卵母細胞，近幾年已涉及的哺乳動物包括兔、山羊、牛、豬及人類等，但馬屬動物的卵母細胞冷凍保存鮮有報道。卵母細胞冷凍液及冷凍保存方法主要借鑒了胚胎冷凍保存液及冷凍保存方法，但是由于卵母細胞結構特殊、體積較大、冷凍時不易充分脫水等特點，其冷凍保存一直較為困難。nakagata用玻璃化冷凍法冷凍小鼠成熟卵母細胞并取得成功后，玻璃化冷凍方法被廣泛用于各種卵母細胞的冷凍保存研究。玻璃化冷凍保存的關鍵是玻璃化冷凍保護劑，是細胞能夠成功冷凍的關鍵因素，其原理是利用高濃度冷凍保護劑在受凍固化時粘度極度增加的特點，使液態變為無結構的玻璃化狀態，同時降低損傷性溶液的濃度，增加非冷凍部分，減少凍融過程中冰晶的產生及卵母細胞或胚胎體積的波動，減少滲透壓和激冷對細胞的損傷，提高卵母細胞或胚胎的復蘇率。目前現有的玻璃化冷凍保護劑組分比較單一，對細胞毒性較大，降溫和復溫過程中抑制冰晶生成效果較差，對細胞的損傷較大，導致卵母細胞或胚胎的復蘇率相對偏低。技術實現要素：為解決馬屬動物卵母細胞及胚胎冷凍保存過程中冰晶對細胞造成的化學、物理損傷及冷凍液對細胞毒性等問題，提高卵母細胞或胚胎的復蘇率，本發明提供一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液及其制備方法、冷凍保存方法和應用。為了實現上述發明目的，本發明提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液，包括基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）3種液體，所述玻璃化液（vs）各組分的含量為：10-20%乙二醇（eg）、6-10%二甲基亞砜（dmso）、6-10%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、0.3-0.8mol/l蔗糖、8-15%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液。所述平衡液（es）各組分的含量為：5-10%乙二醇（eg）、2-6%二甲基亞砜（dmso）、2-6%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、0.1-0.3mol/l蔗糖、2-8%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液。所述基礎液（bs）由體積分數為15-25%滅活的胎牛血清和75-85%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；優選地，所述基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成。所述乙二醇（eg）的分子式為c2h6o2；所述二甲基亞砜（dmso）的分子式為(ch3)2so；所述丙二醇（proh）的分子式為c3h8o2；所述蔗糖的分子式為c12h22o11；所述羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll）的分子式為c181h362n60o33；所述hepes的分子式為c8h18n2o4s；所述羥基磷灰石的分子式為ca10(po4)6(oh)2。優選地，所述玻璃化液（vs）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：10-20%乙二醇（eg）、6-10%二甲基亞砜（dmso）、6-10%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、8-15%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：5-10%乙二醇（eg）、2-6%二甲基亞砜（dmso）、2-6%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、2-8%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol/l蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石。優選地，所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：12-17%乙二醇（eg）、7-9%二甲基亞砜（dmso）、7-9%丙二醇（proh）、18-21%滅活的胎牛血清（ncs）、10-13%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.4-0.7mol的蔗糖和2-4g粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：6-8%乙二醇（eg）、3-5%二甲基亞砜（dmso）、3-5%丙二醇（proh）、17-22%滅活的胎牛血清（ncs）、4-7%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol/l蔗糖和2-4g粒徑為40nm的羥基磷灰石。所述玻璃化液（vs）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：10-20%乙二醇（eg）、6-10%二甲基亞砜（dmso）、6-10%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、8-15%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：5-10%乙二醇（eg）、2-6%二甲基亞砜（dmso）、2-6%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、2-8%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol/l蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石。優選地，每升所述玻璃化液還添加有0.3-0.7g的維生素d；每升所述平衡液還添加有0.2-0.6g的維生素d；更進一步的，所述玻璃化液和所述平衡液中添加的維生素d為維生素d2。其中，所述玻璃化液（vs）、所述平衡液（es）和所述基礎液（bs）的配制方法具體如下：所述玻璃化液（vs）的配制方法為：按照所述體積分數比向所述hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，即可得到所述玻璃化液（vs）。所述平衡液（es）的配制方法為：按照所述體積分數比向所述hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，即可得到所述平衡液（es）。所述基礎液（bs）的配制方法：將所述滅活的胎牛血清（ncs）按照所述體積分數比加入到所述hepes溶液中，即可得到所述基礎液（bs）。為了更好的實現上述發明目的，本發明還提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存方法，所述保存方法為：（1）將需要冷凍的卵母細胞或胚胎放于基礎液（bs）中清洗1-2遍；（2）將清洗完畢的所述卵母細胞或胚胎轉移至平衡液（es）中平衡3-7分鐘；優選地，將清洗完畢的所述卵母細胞或胚胎轉移至平衡液（es）中平衡5分鐘；（3）將平衡過的所述卵母細胞或胚胎迅速轉移至玻璃化液（vs）中，再將含有卵母細胞或胚胎的玻璃化液迅速轉移至一個封閉式拉長麥管(cps管)中，并投入液氮在-196℃溫度下保存，整個此過程在1分鐘內完成。其中，所述基礎液（bs）由以下體積百分比的成分組成：15-25%滅活的胎牛血清和75-85%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；優選地，所述基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成。所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：5-10%乙二醇（eg）、2-6%二甲基亞砜（dmso）、2-6%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、2-8%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol/l蔗糖；所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：10-20%乙二醇（eg）、6-10%二甲基亞砜（dmso）、6-10%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、8-15%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.3-0.8mol的蔗糖。進一步地，所述玻璃化液（vs）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：10-20%乙二醇（eg）、6-10%二甲基亞砜（dmso）、6-10%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、8-15%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石；優選地，所述玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：12-17%乙二醇（eg）、7-9%二甲基亞砜（dmso）、7-9%丙二醇（proh）、18-21%滅活的胎牛血清（ncs）、10-13%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述玻璃化液（vs）還包括0.4-0.7mol的蔗糖和2-4g粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）還包括粒徑為40nm的羥基磷灰石；所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：5-10%乙二醇（eg）、2-6%二甲基亞砜（dmso）、2-6%丙二醇（proh）、15-25%滅活的胎牛血清（ncs）、2-8%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol蔗糖和1-5g粒徑為40nm的羥基磷灰石；優選地，所述平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：6-8%乙二醇（eg）、3-5%二甲基亞砜（dmso）、3-5%丙二醇（proh）、17-22%滅活的胎牛血清（ncs）、4-7%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升所述平衡液（es）還包括0.1-0.3mol蔗糖和2-4g粒徑為40nm的羥基磷灰石。優選地，每升所述玻璃化液還添加有0.3-0.7g的維生素d；每升所述平衡液還添加有0.2-0.6g的維生素d；更進一步的，所述玻璃化液和所述平衡液中添加的維生素d為維生素d2。其中，所述玻璃化液（vs）、所述平衡液（es）和所述基礎液（bs）的配制方法具體如下：所述玻璃化液（vs）的配制方法為：按照所述體積分數比向所述hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，即可得到所述玻璃化液（vs）。所述平衡液（es）的配制方法為：按照所述體積分數比向所述hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，即可得到所述平衡液（es）。所述基礎液（bs）的配制方法：將所述滅活的胎牛血清（ncs）按照所述體積分數比加入到所述hepes溶液中，即可得到所述基礎液（bs）。本發明還提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液的應用，所述玻璃化冷凍保存液適用于馬、驢等所有馬屬動物卵母細胞及胚胎的冷凍保存；更進一步的，所述玻璃化冷凍保存液并不僅限用于馬、驢等所有馬屬動物卵母細胞及胚胎的冷凍保存。本發明的有益效果是：玻璃化冷凍保存液對細胞毒性低、滲透性強、玻璃化冷凍效果明顯，同時顯著降低冷凍和復溫過程中冰晶的產生，保護細胞不受物理性損傷，提高了卵母細胞的存活率，非常適用于馬、驢等馬屬動物卵母細胞或胚胎的玻璃化冷凍保存，有利于人工授精及胚胎移植技術的推廣應用。具體實施方式為能清楚說明本方案的技術特點，下面通過具體實施方式，對本方案進行闡述。實施例1冷凍液一本發明實施例提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液，包括基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）3種液體；其中，基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和體積分數為80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；配制方法為：在無菌環境下，按照體積百分比取滅活的胎牛血清（ncs）加入hepes溶液中，并溶解搖勻，制得10ml基礎液（bs）。平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：8%乙二醇（eg）、4%二甲基亞砜（dmso）、4%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、5%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升平衡液（es）還包括0.25mol蔗糖；配制方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得100ml平衡液（es），置于4℃冰箱備用。玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：16%乙二醇（eg）、8%二甲基亞砜（dmso）、8%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、10%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升玻璃化液（vs）還包括0.5mol的蔗糖；配置方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得10ml玻璃化液（vs），置于4℃冰箱備用。使用本實施例玻璃化冷凍保存液對馬屬動物卵母細胞進行玻璃化冷凍保存。實施例2冷凍液二本發明實施例提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液，包括基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）3種液體；其中，基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和體積分數為80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；配制方法為：在無菌環境下，按照體積百分比取滅活的胎牛血清（ncs）加入hepes溶液中，并溶解搖勻，制得10ml基礎液（bs）。平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：8%乙二醇（eg）、4%二甲基亞砜（dmso）、4%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、5%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升平衡液（es）還包括0.25mol蔗糖和3g粒徑為40nm的羥基磷灰石；配制方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得100ml平衡液（es），置于4℃冰箱備用。玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：16%乙二醇（eg）、8%二甲基亞砜（dmso）、8%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、10%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升玻璃化液（vs）還包括0.5mol的蔗糖和4g粒徑為40nm的羥基磷灰石；配置方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得10ml玻璃化液（vs），置于4℃冰箱備用。使用本實施例玻璃化冷凍保存液對馬屬動物卵母細胞進行玻璃化冷凍保存。實施例3冷凍液三本發明實施例提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液，包括基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）3種液體；其中，基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和體積分數為80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；配制方法為：在無菌環境下，按照體積百分比取滅活的胎牛血清（ncs）加入hepes溶液中，并溶解搖勻，制得10ml基礎液（bs）。平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：8%乙二醇（eg）、4%二甲基亞砜（dmso）、4%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、5%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升平衡液（es）還包括0.25mol蔗糖和0.3g維生素d2；配制方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得100ml平衡液（es），置于4℃冰箱備用。玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：16%乙二醇（eg）、8%二甲基亞砜（dmso）、8%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、10%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升玻璃化液（vs）還包括0.5mol的蔗糖和0.5g維生素d2；配置方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得10ml玻璃化液（vs），置于4℃冰箱備用。使用本實施例玻璃化冷凍保存液對馬屬動物卵母細胞進行玻璃化冷凍保存。實施例4冷凍液四本發明實施例提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存液，包括基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）3種液體；其中，基礎液（bs）由體積分數為20%滅活的胎牛血清和體積分數為80%濃度為10mmol/l的hepes溶液組成；配制方法為：在無菌環境下，按照體積百分比取滅活的胎牛血清（ncs）加入hepes溶液中，并溶解搖勻，制得10ml基礎液（bs）。平衡液（es）由以下體積百分比的成分組成：8%乙二醇（eg）、4%二甲基亞砜（dmso）、4%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、5%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升平衡液（es）還包括0.25mol蔗糖、2g粒徑為40nm的羥基磷灰石和0.4g維生素d2；配制方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得100ml平衡液（es），置于4℃冰箱備用。玻璃化液（vs）由以下體積百分比的成分組成：16%乙二醇（eg）、8%二甲基亞砜（dmso）、8%丙二醇（proh）、20%滅活的胎牛血清（ncs）、10%羧化ε-聚賴氨酸（cool-pll），其余部分為10mmol/l濃度的hepes溶液；每升玻璃化液（vs）還包括0.5mol的蔗糖、3g粒徑為40nm的羥基磷灰石和0.6g維生素d2；配置方法為：按照體積分數比向hepes溶液中加入各成分，溶解搖勻后過濾除菌，制得10ml玻璃化液（vs），置于4℃冰箱備用。使用本實施例玻璃化冷凍保存液對馬屬動物卵母細胞進行玻璃化冷凍保存。實施例5冷凍方法本發明實施例提供了一種馬屬動物卵母細胞玻璃化冷凍保存方法，冷凍保存方法具體為：（1）將需要冷凍的卵母細胞或胚胎放于基礎液（bs）中清洗1-2遍；（2）將清洗完畢的所述卵母細胞或胚胎轉移至平衡液（es）中平衡5分鐘；（3）將平衡過的所述卵母細胞或胚胎迅速轉移至玻璃化液（vs）中，再將含有卵母細胞或胚胎的玻璃化液迅速轉移至一個封閉式拉長麥管(cps管)中，并投入液氮中（-196℃）保存，整個此過程在1分鐘內完成。其中，上述基礎液（bs）、平衡液（es）和玻璃化液（vs）可以為實施例1-4中的任意一種。對比實驗一：利用本公司母馬經超數排卵獲得的100枚卵母細胞進行實驗，其中100枚卵母細胞均形態正常且無明顯空泡及碎片等，將100枚卵母細胞隨機分成5組，每組20枚，分別使用實施例1（實施例1組）、實施例2（實施例2組）、實施例3（實施例3組）和實施例4（實施例4組）的玻璃化冷凍保存液和傳統玻璃化冷凍液（傳統對照組）按照實施例5的方法進行冷凍保存。其中，所使用的傳統玻璃化冷凍液的組分為：基礎液包含體積分數20%滅活的胎牛血清和80%的pbs液；平衡液包含體積分數80%的基礎液、10%乙二醇（eg）和10%的二甲基亞砜（dmso）；玻璃化液包含體積分數60%基礎液、20%乙二醇（eg）、20%二甲基亞砜（dmso）和0.65mol/l蔗糖。冷凍保存4周，取出解凍后，觀察透明帶完整率和卵母細胞存活率（卵母細胞存活標準：沒有明顯的胞漿溢出與皺縮、細胞膜完整、卵周間隙清晰、卵母細胞大小正常）及卵母細胞的受精率（卵母細胞受精的標準：行icsi后18-20小時卵母細胞胞漿內見到兩個原核）。結果見表1。表1透明帶完整率、卵母細胞存活率及受精率對照表組別使用卵數（枚）透明帶完整數（枚）透明帶完整率（%）存活數（枚）存活率（%）受精數（枚）受精率（%）傳統對照組20168015751575實施例1組20189017851680實施例2組20199518901785實施例3組20189017851785實施例4組202010019951890由表1的數據可知，與傳統對照組相比，實施例1組、實施例2組、實施例3組和實施例4組無論在透明帶完整率、卵母細胞的存活率還是在卵母細胞的受精率方面都要高于傳統對照組。對比實驗二：利用本公司母馬經超數排卵獲得的100枚卵母細胞進行實驗，其中100枚卵母細胞均形態正常且無明顯空泡及碎片等，將100枚卵母細胞隨機分成5組，每組20枚，分別使用實施例1（實施例1組）、實施例2（實施例2組）、實施例3（實施例3組）和實施例4（實施例4組）的玻璃化冷凍保存液和傳統玻璃化冷凍液（傳統對照組）按照實施例5的方法進行冷凍保存。其中，所使用的傳統玻璃化冷凍液的組分為：基礎液包含體積分數20%滅活的胎牛血清和80%的pbs液；平衡液包含體積分數80%的基礎液、10%乙二醇（eg）和10%的二甲基亞砜（dmso）；玻璃化液包含體積分數60%基礎液、20%乙二醇（eg）、20%二甲基亞砜（dmso）和0.65mol/l蔗糖。冷凍保存1年，取出解凍后，觀察透明帶完整率和卵母細胞存活率（卵母細胞存活標準：沒有明顯的胞漿溢出與皺縮、細胞膜完整、卵周間隙清晰、卵母細胞大小正常）及卵母細胞的受精率（卵母細胞受精的標準：行icsi后18-20小時卵母細胞胞漿內見到兩個原核）。結果見表2。表2透明帶完整率、卵母細胞存活率及受精率對照表組別使用卵數（枚）透明帶完整數（枚）透明帶完整率（%）存活數（枚）存活率（%）受精數（枚）受精率（%）傳統對照組20157514701470實施例1組20178517851680實施例2組20189018901785實施例3組20189017851680實施例4組20199519951890由表2的數據可知，與傳統對照組相比，實施例1組、實施例2組、實施例3組和實施例4組無論在透明帶完整率、卵母細胞的存活率還是在卵母細胞的受精率方面都要高于傳統對照組。綜上所述，本發明方案的卵母細胞玻璃化冷凍保存方面效果明顯優于傳統玻璃化冷凍保存液，非常適用于馬、驢等馬屬動物卵母細胞和胚胎的玻璃化冷凍保存，有利于人工授精及胚胎移植技術的推廣應用。以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12