一種甘草無性快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組培領域，具體涉及一種利用組織培養技術無性快速繁殖甘草的方法。
【背景技術】
[0002]甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是?科甘草屬多年生草本植物，分布于我國北方干旱、半干旱地區的曖溫帶、寒溫帶大陸型季風候區，海拔高度250-1400米，年平均氣溫3-10°C。甘草莖葉為牲畜良好飼料，根有重要經濟價值，是中藥材中第一位的大宗中藥材，也是我國傳統的出口創匯大宗藥材，同時，甘草還是食品、煙草、化妝品等行業中的重要原材料。為滿足生產和市場對甘草的需求，迫切需要開展大面積的人工種植。甘草的實踐生產繁殖通常采用種子育苗和根狀莖繁殖，但種子萌發率一般只有5-10% (于林清等1999)，采用根狀莖切分進行根狀莖繁殖，用種量大，影響甘草的產量，且繁殖系數低，長期用根莖繁殖易感染病毒，導致種質退化，嚴重影響產量和品質。運用植物組織培養技術，將植物莖尖或腋芽在培養基中培養得到脫毒試管苗，在解決品種退化問題，短時間內獲得大量的優良無性系，加快重要經濟植物的栽培生產中起著極其重要的作用。因此，甘草快速繁殖技術的研發，將是實現工廠化、標準化快速獲得大量優質甘草種苗的重要保障。
[0003]目前已有對甘草進行無菌苗繁殖的研究:利用種子、嫩莖、根狀莖獲得無菌苗，以頂芽誘導或腋芽為外植體誘導叢生芽、以誘導體細胞愈傷組織分化為芽或以花藥誘導愈傷組織分化為芽再誘導叢生芽的發生等途徑繁殖芽，經生根誘導獲得無菌苗。以上所有的培養基均為MS培養基(見Murashige T, Skoog F(1962)A revised medium for rapid growthand b1assay with tobacco tissue cultures.Phys1l Plant 15:473 - 497)添加多種激素。采用的激素有:萘乙酸(NAA 0.1?2mg/L)、6_芐氨基嘌呤(6-BA 0.2?4mg/L)、2，4二氯苯氧乙酸(2，4_D 0.5?lmg/L)、口引噪乙酸(IAA 0.1?lmg/L)、口引噪丁酸(IBA 0.1?lmg/L)、6_糠基氨基嘌呤(KT 0.2?2mg/L)。2012年6月27日，藺海明和柳福智獲得授權專利“甘草優質種苗快速繁殖的方法”(專利號為ZL201110024490.5)，該發明將種子接種MS培養基萌發培養無菌苗，后切取無菌苗的莖桿，接入MS+KH2P0410mg/L+NAA 0.5mg/L培養基進行培養獲得無菌苗。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種操作簡單、出苗快，能高效地無性繁殖多個甘草種的甘草無性快速繁殖方法。
[0005]本發明對甘草多個品種進行了大田枝條取材培養無菌苗，以腋葉和頂芽為外植體快速繁殖增殖芽，為甘草無性繁殖提供一種操作簡單、設備要求低、繁殖快、再生苗成活高、適用于多個甘草品種的無性快速繁殖的方法，可為甘草產業人工種植提供大量優質種苗。
[0006]本發明的甘草無性快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0007]a.無菌苗的培養:取甘草嫩枝并切除葉片，消毒后，將甘草嫩枝切成至少帶有1個腋芽的莖段外植體，然后將莖段外植體接種到培養基中，待腋芽生根枝條伸長至含有5?8個腋芽，得到無菌苗；
[0008]b.無菌苗的繼代增殖:將無菌苗切成頂芽外植體、至少帶有1個腋芽的莖段外植體和至少帶有1個腋芽和根的外植體，將上述外植體接種到新的培養基中培養，得到繼代增殖的無菌苗；
[0009]c.無菌苗的移栽:將繼代增殖的無菌苗取出，洗掉根部培養基，移栽至栽培基質中培養，得到甘草種苗；
[0010]所述的步驟a和b的培養基的配方為:每升培養基含有0.lmg IBA,余量為訊03和ΝΗ4Ν03用量均減半的MS培養基，pH5.8。
[0011]甘草種苗可以移到大田中培養。
[0012]所述的謂03和NH 4N03用量均減半的MS培養基，是指ΚΝ0 3和NH 4N03用量相對于常規MS培養基中的謂03和NH 4勵3用量減半，其他相同。
[0013]優選，所述的甘草為烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(Radix Glycyrrhizae Glabrae)或脹果甘草(Glycyrrhiza inf lata Batalin) 0
[0014]優選，所述的步驟a的消毒是將甘草嫩枝用自來水沖洗10分鐘后，放入質量分數為0.1%的多菌靈溶液中浸泡5-10分鐘，再用自來水洗滌5次，將嫩枝切成5厘米長莖段，用體積分數為75%酒精浸泡30秒，用無菌水沖洗1遍后，將莖段取出置于質量分數為
0.1 %的升汞溶液消毒10分鐘，再用無菌水沖洗6遍，用無菌紙將莖段水分吸干，得到消毒后的甘草嫩枝。
[0015]優選，所述的步驟c的栽培基質是將沙、蛭石和營養土按質量比為1:1:2混合均勻而得。
[0016]優選，所述的步驟c的移栽至栽培基質中培養，是將洗掉根部培養基的繼代增殖的無菌苗栽入栽培基質中，蓋上保鮮膜，在膜上打些小孔，置于22±1 °C，光強50?ΙΟΟμπιοΙ πΓ?光照12h/天條件下培養，7天后揭去保鮮膜，繼續培養3天后，移至玻璃溫室培養，得到甘草種苗。
[0017]本發明的無菌苗的培養和無菌苗的繼代增殖，在培養基上培養時，其培養溫度和光照條件為甘草組培的常規培養溫度和光照條件，優選為:22±1°C、光強50?ΙΟΟμπιοΙnT2s-1、光照 12h/ 天。
[0018]所述的MS培養基為國際通用的培養基，其成份和配置方法見Murashige T, SkoogF(1962)A revised medium for rapid growth and b1assay with tobacco tissuecultures.Phys1l Plant 15:473 - 497。
[0019]本發明提供了一種甘草無性快速繁殖方法，具有操作簡單、出苗快的特點。本發明繁殖所用的外植體均來自于田間甘草嫩枝發育而來的腋芽和頂芽，只用1種培養基，省略一般再生芽需生根誘導后才能移苗所需要的不同培養基和時間，而且無菌苗成活高，無菌苗生根誘導率為100 %，40天就能出苗，50天后可移栽大田，移栽大田成活率為80 %以上。而且該方法可適用于多個甘草種的多個優良株系的快速繁殖，該技術在甘草可持續發展中具有顯著的生態、經濟和社會效益意義。
【附圖說明】
[0020]圖1為培養烏拉爾甘草嫩枝腋芽獲得的無菌苗。
[0021]圖2為無菌苗被切成帶有頂芽、腋芽外植體接種新培養基后伸長生長為繼代增殖的無菌苗。其中，a為頂芽外植體，b為帶有1個腋芽的莖段外植體，c為基部帶有1個腋芽和根的外植體；d、e、f分別對應為由a、b、c的外植體伸長生長得到的繼代增殖的無菌苗。