一種骨髓抑制小鼠模型的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學技術領域。具體涉及一種骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
【背景技術】
[0002]骨髓抑制是大多數化療、放療藥物共有的不良反應，表現為外周血單系或全系血細胞減少等造血系統的改變。環磷酰胺導致骨髓抑制的研究已有不少報道，但是采用環磷酰胺復制骨髓抑制模型尚無統一標準，環磷酰胺的使用劑量及時間尚存在爭議，導致骨髓抑制動物模型的成模率低、可重復性差，從而影響其發病機理及藥物防治骨髓抑制的療效研究。
[0003]如何建立一種明確的、可重復性的骨髓抑制動物模型，對深入研究其發病機制及探討其有效防治方法，以及驗證各種抗骨髓抑制藥物的療效和作用機理，都是一項至關重要的課題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了解決目前骨髓抑制動物模型的成模率低、可重復性差的問題，提供一種成模率高、可重復性好的骨髓抑制小鼠模型的建立方法。本發明公開的建立骨髓抑制模型的方法，操作簡單，成模率高，可重復性好，可以用于各種實驗動物，為骨髓抑制實驗研究奠定了基礎，有利于客觀、準確的驗證各種藥物防治骨髓抑制的療效及作用機理，有利于進一步指導臨床治療方案的選擇與評價，有利于指導治療骨髓抑制新藥的藥理實驗與開發研制。
[0005]為實現上述目的，本發明采用了如下技術方案:
[0006]骨髓抑制小鼠模型的建立方法，選擇6周齡N0D/SCID雄性小鼠55只，隨機分為正常組、對照組及模型I組、模型2組、模型3組、模型4組。除正常組外，其余各組再分為a組(連續給藥組)、b組(隔日給藥組)，共11小組，每組5只。模型組分別經腹腔連續注射及隔日注射不同劑量環磷酰胺(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg)，對照組以生理鹽水代替，正常組不加任何干預措施，觀察15d，評價各組小鼠存活率、外周血細胞數、骨髓病理形態、骨髓造血干細胞陽性率。
[0007]下面通過詳細的實驗結果來說明本發明一一骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
[0008]I材料和方法
[0009]1.1材料
[0010]1.1.1實驗動物及分組選用6周齡勵0/^10雄性小鼠55只，體重(23±4化，3??級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，飼養在上海中醫藥大學實驗動物中心室內，室溫(27± I) °C，食用全價營養顆粒飼料。適應性喂養3天，隨機分為5大組(正常組、對照組、模型I組、模型2組、模型3組、模型4組)，除正常組外，每組再分為a組(連續給藥組)、b組(隔日給藥組)，共11小組，每組5只。
[0011]1.1.2藥物及試劑環磷酰胺注射液，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。LineageCell Deplet1n Kit試劑盒，購自德國美天旎Miltenyi公司。生物素化抗體(CD3e、B220、Grl、Terll9、Macl)，購自BD Pharmingen公司。抗生物素微磁珠(Magnetic Beads)，購自德國美天旎Miltenyi公司。Sca — 1、c 一Kit抗體，購自eB1science公司。
[0012]1.1.3儀器設備LEICA—RM2135型切片機，LEICA—DME光學顯微鏡，上海徠卡顯微系統有限公司。RT-7300全自動血細胞分析儀，中國深圳雷杜公司。BD Accuri C6流式細胞儀，美國BD公司。
[0013]1.2 方法
[0014]1.2.1給藥方法根據初始體重給藥，除正常組、對照組外，其余各組以環磷酰胺腹腔注射。
[0015]正常組:不加任何干預措施。
[0016]對照a組:生理鹽水腹腔注射，每日I次，連續3d。
[0017]對照b組:生理鹽水腹腔注射，隔日I次，連續3次。
[0018]模型Ia組:50mg/kg體重，每日I次，連續3d。
[0019]模型2a組:100mg/kg體重，每日I次，連續3d。
[0020]模型3a組:150mg/kg體重，每日I次，連續3d。
[0021 ] 模型4a組:200mg/kg體重，每日I次，連續3d。
[0022]模型Ib組:50mg/kg體重，隔日I次，連續3次。
[0023]模型2b組:100mg/kg體重，隔日I次，連續3次。
[0024]模型3b組:150mg/kg體重，隔日I次，連續3次。
[0025]模型4b組:200mg/kg體重，隔日I次，連續3次。
[0026]實驗自給藥開始起，連續觀察15天。
[0027]1.2.2觀察癥狀體征實驗自開始起，每周稱重I次，觀察小鼠的體形、毛色、步態、覓食及活動情況，并記錄動物每天死亡只數。
[0028]1.2.3外周血細胞數實驗自開始起，每3日尾部取血I次，2mM EDTA/PBS稀釋50倍，全自動血細胞分析儀檢測外周血白細胞、紅細胞、血小板數。
[0029]1.2.4觀察骨髓病理形態第15日用頸椎脫臼法處死小鼠，取右側股骨，4%多聚甲醛固定24小時，10 %EDTA脫鈣液脫鈣28d，石蠟包埋，分別制成4張厚約4m連續石蠟切片，將石蠟切片置于37°C烤箱過夜后，經二甲苯脫蠟后梯度乙醇復水，蘇木精染色5min，經1%鹽酸乙醇分色，自來水充分沖洗藍化后，再用0.1 %伊紅復染5min，最后經梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，封片。普通光鏡下觀察骨髓組織切片病理形態的改變。
[0030]1.2.5骨髓造血干細胞陽性率取左側股骨、雙側髖骨、雙側脛骨，置于5ml含2mMEDTA的PBS液中，用3ml注射器反復沖洗骨髓腔，收集全部骨髓細胞，Ficoll密度梯度離心法分選BMNC細胞，MACS沖洗I遍，Lineage Cell Deplet1n免疫磁珠分選Lin—細胞(根據試劑盒操作)，加入SAV-FITC、Scal —PE、c 一Kit-APC熒光抗體，冰上孵育30min，MACS沖洗I遍，流式細胞儀檢測骨髓造血干細胞(Lineage——Scal+—c-Ki t+，LSK細胞)陽性率。
[0031 ] 2 結果
[0032]2.1癥狀表現
[0033]除正常組外，其它各組小鼠于造模后逐漸均出現體重、體溫下降，活動減少，反應遲鈍，畏寒蜷臥，體毛疏松，失去光澤，進食量、飲水量減少，尿量增多等表現，于造模后第9 一 12天左右，上述癥狀達到最高峰。造模后第15天開始，上述癥狀逐漸減輕。
[0034]2.2存活率統計
[0035]與正常組相比，對照a組、對照b組、模型Ia組、模型Ib組、模型2a組、模型2b組及模型3b組未出現死亡，模型3a組出現少量死亡，模型4a組、模型4b組在觀察期間出現大量死亡或全部死亡(圖1)。
[0036]2.3外周血細胞數
[0037]我們將無小鼠死亡的組別一一正常組、生理鹽水a組、生理鹽水b組、模型Ia組、模型Ib組、模型2a組、模型2b組以及模型3b組外周血細胞數進行比較，結果如下:
[0038]2.3.1白細胞數
[0039]與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時間點白細胞數未見明顯差異(P>0.05)。模型2a組、模型2b組白細胞數自第3日起呈現逐漸下降趨勢，第9日開始逐漸上升，至15日時基本恢復正常。模型3b組在第6日時下降到最低點(P〈0.01),至15日時，仍保持在較低水平，與正常組比較，差異有非常顯著性意義(P〈0.01)(圖2)。
[0040]2.3.2紅細胞數
[0041 ] 與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時間點紅細胞數未見明顯差異。模型2a組、模型2b組、模型3b組紅細胞數自第3日起呈現逐漸下降趨勢。其中，模型2a組在第9日時下降到最低點、模型2b組在第6日時下降到最低點，其后逐漸恢復。模型3b組在第12日時下降到最低點(P〈0.01)，至15日時仍保持在較低水平(P〈0.01)(圖
3)0
[0042]2.3.3血小板數
[0043]與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時間點血小板計數未見明顯差異。模型2a組、模型2b組、模型3b組血小板數自第3日起呈現逐漸下降趨勢，其中，模型2b組在第9日時下降到最低點，模型2a組、模型3b組在第12日時下降到最低點(Ρ〈0.01)(圖4)。
[0044]2.4普通光鏡觀察結果
[0045]普通光鏡觀察正常組、生理鹽水Ib組、模型3b組骨髓組織病理形態，結果如下:
[0046]正常組、生理鹽水Ib組:小鼠骨髓組織結構完整，可見大量紅細胞、單核細胞及巨核細胞，