肝素的轉基因生產的制作方法

肝素的轉基因生產的制作方法
【專利摘要】本申請提供了用于生產肝素的方法、細胞和轉基因非人哺乳動物。具體地，所述方法包括提供轉基因非人哺乳動物或修飾的乳腺上皮細胞以表達一個或多個肝素生物合成酶，并收集所產生的肝素。進一步提供了所述細胞、其轉基因非人哺乳動物、以及從這些細胞或轉基因非人哺乳動物獲得的肝素。
【專利說明】肝素的轉基因生產
[0001] 相關申請
[0002] 本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2013年12月24日提交的美國臨時專利申請序號 61/920,505,名稱為"肝素的轉基因生產"的優先權，其全部內容通過引用并入本申請。 發明領域
[0003 ]本申請涉及生物化合物的轉基因生產領域。
[0004] 發明背景
[0005] 肝素是一種作為抗凝劑廣泛使用的復雜的糖胺聚糖。通常從動物小腸或牛肺中收 集肝素。然而，存在肝素污染的問題。因而，需要用于生產肝素的新方法。
[0006] 發明概述
[0007] 在一個方面，本申請提供了用于生產肝素的方法、細胞和轉基因哺乳動物。在一個 實施方式中，提供了在其乳汁中生產肝素的轉基因非人哺乳動物。在一個實施方式中，提供 了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺 乳動物已被修飾以便在其乳腺中表達一種或多種肝素合成酶，和從所述轉基因哺乳動物乳 腺生產的乳汁中收集肝素。在一個實施方式中，提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括 提供一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表達一 種或多種肝素合成酶和核心蛋白，和從所述轉基因哺乳動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。
[0008] 在另一個方面，提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供乳腺上皮細胞，所 述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素生物合成酶，和從乳腺上皮細胞收集肝 素。在一個實施方式中，提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供乳腺上皮細胞，所 述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素合成酶和核心蛋白，和從乳腺上皮細胞收 集肝素。
[0009] 在另一個方面，提供了一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物已被 修飾以便在其乳腺中表達一種或多種肝素合成酶。在一個實施方式中，提供了一種轉基因 非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表達一種或多種肝素合 成酶和核心蛋白。
[0010] 在另一個方面，提供了乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或 多種肝素生物合成酶。在一個實施方式中，提供了乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修 飾以表達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白。
[0011] 在一個實施方式中，所述轉基因哺乳動物是有蹄類。在另一個實施方式中，所述有 蹄類是山羊。在另一個實施方式中，所述有蹄類是牛。
[0012] 在提供任意方法、細胞或哺乳動物的一個實施方式中，所述肝素生物合成酶選自 下組：四糖產生物、重復單元產生物、重復單元修飾物、差向異構化物、硫酸化酶和支持酶。 在另一個實施方式中，四糖產生物是XTII、GalT-l或GlcAT-1。在另一個實施方式中，重復單 元產生物是EXT1聚合酶和EXT2聚合酶。在另一個實施方式中，重復單元修飾物是NDSTI和 NDSTII。在另一個實施方式中，差向異構化物是C5差向異構酶。在另一個實施方式中，硫酸 酶是3-OST、6-0ST或2-0ST。在另一個實施方式中，支持酶是UDPGDH。
[0013] 在提供任意方法、細胞或哺乳動物的另一個實施方式中，一種或多種肝素生物合 成酶和核心蛋白已被修飾以使得GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定被操縱。在一個實施方式中，將 GPI錨定加入核心蛋白以定向至膜。在另一個實施方式中，GPI錨定缺失以使其分泌進入乳 汁。在另一個實施方式中，肝素生物合成酶和核心蛋白已被修飾以使得在脂肪球膜中生產 肝素和生物合成酶。在另一個實施方式中，一個或多個肝素生物合成酶在乳啟動子(milk promoter)的控制下。在另一個實施方式中，乳啟動子是山羊β酪蛋白啟動子。
[0014] 在一個方面，提供了根據所提供的任意一種方法生產的肝素。
[0015] 本發明的每個限制可以包括本發明的不同實施方式。因此，預期包括任意一個元 素或元素的組合的本發明的每個限制可以包括在本發明的每個方面中。本發明不限于將其 應用于下述說明書所述的或附圖中所示的構造的細節和組成的排布。本發明能夠有其他實 施方式和以不同方式實踐或實施。而且，在本申請中使用的措辭和術語用于描述目的并且 不應被視為是限制性的。
[0016] 附圖簡述
[0017]附圖僅是說明性的并且不需要用于本申請的實施。
[0018] 圖1提供了肝素生物合成酶途徑的示意圖。
[0019] 發明詳述
[0020] 在一個方面，本申請提供了用于生產肝素的方法、細胞和轉基因非人哺乳動物。盡 管此前已有報道給予肝素可引起副作用，其可能有時是非常嚴重的，如出血、瘀點、紫癜或 瘀斑，但是令人吃驚的是本申請證實了低劑量和中劑量全身和乳腺輸注肝素對哺乳動物的 健康和產奶量具有極小影響，從而允許在轉基因哺乳動物中生產肝素。
[0021] 肝素是糖胺聚糖(GAG)家族成員，其由聚陰離子、多分散性、線性的由重復二糖單 元組成的多糖組成。在肝素中主要的二糖是艾杜糖醛酸（IdoA)和N-乙酰基-D-葡糖胺 (GlcNAc)，或者D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)。然而，由于這些二糖的 進一步修飾，使得在肝素聚合物鏈中具有顯著的異質性(見下文中對生物合成的描述）。肝 素通常由重量通常在3kDa至40kDa之間的約10-200個二糖組成（Sas isekharan等，Curr Opin Chem Biol 4:626-631(2000))<^Α(：如肝素能夠與核心蛋白的絲氨酸殘基共價結合， 作為在糖合成發生位置的錨定，得到稱為蛋白糖胺的糖綴合物。
[0022] 肝素通常存在于細胞外膜并且在圍繞著細胞的細胞外基質中。肝素與多種肝素結 合分子相互作用以條件多種生物過程，包括例如細胞生長、細胞分化、免疫、代謝、細胞信 號、炎癥、凝血和癌癥。已鑒定在無脊椎動物和脊椎動物中存在肝素和肝素樣分子，并且從 很多物種中分離的分子似乎能夠激發至少一些相同的生物過程例如抗凝血（參見例如 Medeiros等，Biochim Biophys Acta 1475(3) :287-294(2000)和Pejler等，J Biol Chem 262(24):11413-21(1987))〇
[0023] 肝素參與重要的生物過程(特別是凝血、炎癥和癌癥）導致使其作為藥物使用。已 廣泛地對肝素在凝血中的作用進行了研究。肝素是一種由嗜堿性粒細胞和肥大細胞產生的 天然存在的抗凝劑。肝素通過阻止血液系統中的凝塊形成和現有凝塊擴大作為抗凝劑。這 通過肝素與抗凝血酶IIKAT)結合實現，其導致產生使得AT活化的構象改變。然后活化的AT 將凝血酶和參與凝血的其他蛋白酶滅活，阻止凝血起始或進一步凝血。肝素目前廣泛作為 抗凝血藥物使用，年用量超過100公噸（參見例如Laremore等，Curr Opin Chem Biol 13(5- 6) :633-640(2009))。肝素通常適用于例如深部靜脈血栓和肺栓塞、急性冠狀動脈綜合征、 心房纖顫、心肺轉流、血液濾過、中央置管或外周靜脈導管。因為肝素與多種調控除了凝血 以外的其他過程的肝素結合蛋白相互作用，所以涉及使用肝素治療的針對多種其他疾病的 臨床試驗正在進行中，例如成人呼吸窘迫綜合征、過敏性鼻炎、哮喘和炎性腸病。此外，肝素 在動物模型中還顯示出具有抗轉移性，使其還具有用于癌癥治療的潛力(Borsig等，Proc Natl Acad Sci USA98(6):3352-3357(2000))。
[0024] 在通常情況下，在患者中使用的肝素是通過在屠宰牲畜中分離天然存在的肝素制 備的，因為人肝素在結構和功能上與其他哺乳動物肝素是類似的（參見例如Linhardt等， Biochemistry 31 (49): 12441-5(1992))。然而，在2008年含多硫酸軟骨素污染的肝素導致 多名患者死亡（參見例如Sasisekharan等，Thromb Haemost 102:854-858(2009))。其結果 是，有必要開發一種從確定的和受控的來源生產肝素的替代方法。目前經過測試的代替從 屠宰牲畜中分離肝素的方法包括化學合成、化學酶合成和離體基于細胞的合成。然而，這些 方法具有缺點，因為它們是昂貴的、在技術上具有挑戰性和/或無法囊括體內存在的各種肝 素(參見例如Laremore等，Curr Opin Chem Biol 13(5-6) :633-640(2009))。需要開放生產 肝素的替代方法。
[0025] 因此，本發明提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供已被修飾以便在其 乳汁中表達肝素的轉基因非人哺乳動物。在一個方面，本發明提供了一種生產肝素的方法， 所述方法包括提供已被修飾以便在其乳腺中表達一種或多種肝素生物合成酶的轉基因非 人哺乳動物，和從所述轉基因動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。
[0026]本發明的另一個方面提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供已被修飾以 便在其乳腺中表達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白的轉基因非人哺乳動物，和從所 述轉基因動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。
[0027]在一個方面，在轉基因哺乳動物中生產肝素指增加肝素的表達使其高于在哺乳動 物中已存在的水平(例如在轉基因山羊中生產升高水平的山羊肝素）。在另一個方面，在轉 基因哺乳動物中生產肝素指生產不是在該哺乳動物中天然存在的肝素的直系同源物(例如 在轉基因山羊或奶牛中生產的人肝素）。在另一個方面，在轉基因哺乳動物中生產肝素指生 產不是在該哺乳動物中天然存在的混合肝素(例如使用山羊和人酶的組合在轉基因山羊中 生產肝素）。因為肝素和肝素樣分子已顯示出激發類似的生物應答(例如用于治療人疾病的 動物肝素和無脊椎動物肝素樣分子的抗凝血性質），應意識到從轉基因動物中獲得的肝素 不限于人或非人哺乳動物肝素，還包括肝素的變體和肝素樣分子。
[0028]在一個方面，本發明提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供已被修飾以 表達一種或多種肝素生物合成酶的乳腺上皮細胞，和從所述乳腺上皮細胞收集肝素。
[0029]在另一個方面，本發明提供了一種生產肝素的方法，所述方法包括提供已被修飾 以表達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白的乳腺上皮細胞，和從所述乳腺上皮細胞收 集肝素。
[0030]參與肝素生物合成（"肝素生物合成酶"）的主要的酶是本領域公知的（參見例如 Baik等，Metabolic engineering 14:81-90(2012))。認為生物合成途徑至少涉及十二個酶 促步驟并且在圖1中進行了概述。存在在其上發生糖合成的作為錨定使用的核心蛋白。這種 核心蛋白被轉運至糖酶駐留在其中的尚爾基體。最初，將四糖鍵加入核心蛋白的Ser殘基。 其通過經由四種不同的酶催化順序加入完成，依次加入木糖，然后是兩個半乳糖殘基，隨后 是葡糖醛酸。產生四糖的酶是XTI和ΧΤΠ ，用于將木糖加入核心蛋白上的Ser，B4GalT7(m， 4-半乳糖基轉移酶)和B3GALT6(i31，3-半乳糖基轉移酶），其加入半乳糖殘基和B3GAT3(GlcA β1，3-葡糖醛酸基轉移酶），其加入葡糖醛酸。在本申請中將產生四糖的酶稱為四糖產生物 并且其包括表1中所列的基因。
[0031]下一步是加入GlcNAC，其確定將在蛋白上合成肝素或硫酸乙酰肝素。在一個替代 模式中，將酶EXTI和EXT2加入G1 cNAC和G1 cA重復單元，其導致肝素的聚合。在本申請中將聚 合鏈的酶稱為"重復單元產生物"并且其包括表2中所列的基因。
[0032] 重復單元經由GlcNAC N-脫乙酰基酶和N-磺基轉移酶（例如NDST I和NDST II)修 飾。NDST乙酰化和硫酸化選定的GlcNAC殘基以生產GlcNS(NDST II有時與PAPS硫酸供體一 起工作）。在本申請中將該步驟中使用的酶稱為重復單元修飾物并且并且其包括表3中所列 的基因。
[0033] 在下一個步驟中，其可以發生在利用重復單元修飾物修飾之前、修飾過程中或之 后，C5差向異構酶（"差向異構化物"）發揮作用將葡糖醛酸(Glc A)子集轉化為艾杜糖醛酸 (IdoA)。差向異構化物包括表4中所列的基因。
[0034] 在這之后，一系列硫酸基轉移酶發揮作用并修飾重復單元，將硫酸加入重復單元 子集。將在該步驟中使用的這些酶稱為"硫酸化酶"，包括3-0-磺基轉移酶、6-0-磺基轉移酶 和2-0-磺基轉移酶(分別為3-0ST、6-0ST和2-0ST)并且相關基因列于表5中。
[0035] 在進行這些修飾后，在肝素中存在的主要的修飾的和未修飾的二糖包括但不限于 GlcA-GlcNAc、GlcA-GlcNS、IdoA-GlcNS、IdoA(2S)-GlcNS、IdoA-GlcNS(6SWPIdoA(2S)- GlcNS(6S)〇
[0036] 適宜的四糖產生物的示例包括但不限于表1中的基因：
[0037]
[0038] 表 1
[0039] 適宜的重復單元產生物的示例包括但不限于表2中的基因。
[0040]
[0041]
[0042] 表 2
[0043] 適宜的重復單元修飾物的示例包括但不限于表3中的基因。
[0044]
[0045]
[0046] 表 3
[0047] 適宜的差向異構化物的示例包括但不限于表4中的基因。
[0048]
[0049] 表 4
[0050] 適宜的硫酸化酶的示例包括但不限于表5中的基因：
[0052]
[0053] 表 5
[0054] 用于合成肝素的核心蛋白的示例包括但不限于表6中所列的那些：
[0055]
[0056]
[0057] 應意識到酶序列可因物種而異。因而，例如，牛NDST I可以與人NDST I具有不同的 序列。在一些實施方式中，在本申請所述的方法中使用物種特異性酶。因而，例如，在轉基因 山羊中使用山羊肝素生物合成酶。然而，在一些實施方式中，一個物種的肝素生物合成酶可 以用在不同的物種中。因而，例如，將人肝素生物合成酶用在（即表達)轉基因哺乳動物中 (例如轉基因山羊）。還應意識到不同物種的酶可以是"混合的和匹配的"。因而，在一些實施 方式中，轉基因哺乳動物如轉基因山羊可以具有人肝素生物合成酶和其他哺乳動物的肝素 生物合成酶作為轉基因。
[0058] 從轉基因動物中純化肝素
[0059] 在一些實施方式中，從生產肝素的轉基因動物的乳汁中純化肝素。在一些實施方 式中，從轉基因動物的乳汁中純化肝素以使得所述肝素是基本上純的。在一些實施方式中， 基本上純的包括基本上無污染物。在一些實施方式中，污染物包括多硫酸軟骨素。
[0060] 在一些實施方式中，肝素是使用柱層析純化的。柱層析是本領域熟知的（參見基本 實驗室技術單元6.2(2008)中用于通用層析的現行方案和1^4，119,774中肝素的純化）。在 一些實施方式中，肝素是通過免疫共沉淀純化的（參見細胞生物學單元7.2(2001)中的現行 方案）。在一些實施方式中，使用肝素結合抗體或其片段純化肝素。
[0061 ]用于產生在乳汁中表達肝素的轉基因動物的構建體
[0062] 在一些實施方式中，為了生產在利用核轉移生產轉基因動物(例如山羊）中使用的 含有構建體(例如編碼一種或多種肝素生物合成酶或編碼一種或多種肝素生物合成酶和核 蛋白）的原代細胞系，可以將該構建體轉染至原代動物皮膚上皮細胞，對其進行克隆擴增和 完全鑒定以評估轉基因拷貝數、轉基因結構完整性和染色體整合位點。如在本申請中所使 用的，"核轉移"指一種克隆方法，其中所述核從供體細胞移植進入去核卵母細胞。
[0063] 目標蛋白的編碼序列（例如肝素生物合成酶或肝素生物合成酶和核心蛋白）可以 通過篩選來源于從序列數據庫如NCBI、Genbank的所選動物(如有蹄類）的基因組材料或反 向翻譯的信使RNA文庫獲得，或者通過肝素生物合成酶的序列獲得，等等。可以將序列克隆 進入適宜質粒載體并擴增進入適宜宿主生物體，如大腸桿菌。
[0064]在載體擴增后，可以切除編碼該基因的DNA，將其從剩余載體中純化并且引入能夠 用于生產轉基因動物的表達載體中。在載體擴增后，還可以使用適宜的5'和3'控制序列切 除DNA構建體，將其從剩余載體中純化并且用于生產已將所需的表達構建體整合至其基因 組的轉基因動物。相反地，某些載體，如酵母人工染色體(YAC)，沒有必要從載體中除去已組 裝的構建體;在這種情況下可以將擴增的載體直接用于制備轉基因動物。可以將編碼序列 與控制序列可操作地連接，其能夠使編碼序列在轉基因非人哺乳動物的乳腺中表達。
[0065] 適于指引在轉基因動物乳汁中生產肝素生物合成酶的DNA序列可以攜帶來源于天 然來源的乳蛋白的5'-啟動子區域。這個啟動子由此在激素和組織特異性因子的控制下并 且是哺乳期乳腺組織中最活躍的。在一些實施方式中，該啟動子是山羊β酪蛋白啟動子。該 啟動子可以與指示蛋白前導序列產生的DNA序列可操作地連接，其指示轉基因蛋白從乳腺 上皮分泌進入乳汁。在一些實施方式中，可以加入來源于天然分泌乳蛋白的3'-序列以改善 mRNA的穩定性。
[0066] 如在本申請中所使用的，"前導序列"或"信號序列"是編碼蛋白分泌信號的核酸序 列，當與編碼轉基因蛋白的下游核酸分子可操作地連接時指引分泌。前導序列可以是天然 前導序列、來源于人工的前導序列，或者可以來自與指引轉基因編碼序列的轉錄使用的啟 動子相同的基因，或來自從細胞如哺乳動物乳腺上皮細胞中正常分泌的其他蛋白。
[0067] 在一些實施方式中，啟動子是乳特異性啟動子。如在本申請中所使用的，"乳特異 性啟動子"是天然地指引在將蛋白分泌進入乳汁的細胞中（例如乳腺上皮細胞)的基因表達 的啟動子，并且包括例如酪蛋白啟動子，例如α_酪蛋白啟動子(例如aS-Ι酪蛋白啟動子和α S2-酪蛋白啟動子）、β_酪蛋白啟動子（例如山羊β酪蛋白基因啟動子（DiTullio等， BioTechnology 10:74-77(1992)))、γ-酪蛋白啟動子、κ-酪蛋白啟動子、乳清酸性蛋白 (WAP)啟動子(Gordon等，BioTechnology 5:1183-1187(1987))、β-乳球蛋白啟動子(Clark 等，BioTechnology 7:487-492( 1989))和α-乳清蛋白啟動子（Soulier等，FEBS Letts · 297: 13(1992))。在該定義中還包括特異性在乳腺組織中活化的啟動子，例如小鼠乳腺腫瘤病毒 (MMTV)長末端重復(LTR)啟動子。
[0068] 如在本申請中所使用的，當其以這樣一種方式共價連接以安置在調控序列的影響 或控制下編碼序列的表達或轉錄時，將編碼序列和調控序列稱為"可操作地連接"。為了使 編碼序列翻譯成功能性蛋白，將編碼序列與調控序列可操作地連接。如果誘導5'調控序列 中的啟動子導致編碼序列的轉錄和如果兩個DNA序列之間連接的性質（1)不會導致引入移 碼突變，（2)不會被指引編碼序列轉錄的啟動子區域的能力干擾或(3)不會被翻譯成蛋白的 相應RNA轉錄本的能力干擾，則將兩個DNA序列稱為是可操作連接的。因此，如果啟動子區域 能夠影響DNA序列的轉錄以使得所得到的轉錄本可以翻譯成所需的蛋白或多肽，則啟動子 區域與編碼序列是可操作地連接的。
[0069] 如在本申請中所使用的，"載體"可以是任意數量的核酸，在其中可以通過限制和 連接插入所需序列，以供在不同基因環境之間轉運或在宿主細胞中表達。載體通常由DNA組 成，但是RNA載體也是可用的。載體包括但不限于質粒和噬菌粒。克隆載體是能夠在宿主細 胞中復制的，并且其進一步的特征為具有一個或多個限制性內切酶位點，載體在其中可以 以可確定的方式切割并且在其中可以將所需的DNA序列連接，以使得新的重組載體保留其 在宿主細胞中復制的能力。在質粒的情況下，所需序列的復制隨著宿主菌中質粒拷貝數的 增加可以發生多次，或者隨著通過有絲分裂產生宿主復制物每個宿主僅發生一次。在噬菌 體的情況下，復制在溶菌期可以主動發生或在溶原期被動發生。表達載體是在其中所需DNA 序列可以通過限制和連接插入以使得其與調控序列可操作地連接并且可以作為RNA轉錄本 表達。載體還可以含有一個或多個適于在細胞的鑒定中使用的標記物序列，其已被或未被 該載體轉化或轉染。標記物包括例如編碼對抗生素或其他化合物具有抗性或敏感性導致其 增加或減少的蛋白的基因，編碼其活性可以通過本領域公知的標準測定方法檢測的酶的基 因（例如β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶），和對轉化或轉染細胞、宿主、菌落或噬菌斑的表型產 生可見影響的基因。優選的載體是那些能夠自主復制并且表達在與之可操作地連接的DNA 區段中存在的結構基因產物的那些。
[0070] 轉基因動物和乳腺上皮細胞
[0071] 在一個方面，本申請提供了一種在其乳汁中生產肝素的轉基因非人哺乳動物。特 別地，本申請提供了一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物在乳腺中表達一 種或多種肝素生物合成酶。本申請還提供了一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺 乳動物在乳腺中表達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白。
[0072] 在另一個方面，提供了乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞表達一種或多種肝素生 物合成酶。還提供了乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞表達一種或多種肝素生物合成酶和 核心蛋白。
[0073] 可以根據本領域公知的方法產生轉基因動物。在一個實施方式中，通過將原代細 胞與單獨的構建體共轉染產生該動物。然后可以將這些細胞用于核轉移。或者，可以使用顯 微注射產生轉基因動物，并且可以將構建體注射。
[0074] 適于轉基因表達的動物包括但不限于山羊、綿羊、野牛、駱駝、奶牛、家兔、水牛、馬 和羊駝。適宜的動物還包括牛、山羊和綿羊，其分別涉及不同種類的奶牛、山羊和綿羊。適宜 的動物還包括有蹄類。如在本申請中所使用的，"有蹄類"是或屬于偶蹄類，通常是食草的四 足哺乳動物，包括但不限于綿羊、山羊、牛和馬。
[0075] 克隆將導致產生大量的轉基因動物一一其均能夠生產肝素生物合成酶或其他目 標基因構建體。生產方法包括使用克隆的動物和這些動物的后代。在一些實施方式中，克隆 的動物是山羊或牛。克隆還包括胎兒的核轉移、核轉移、組織和器官抑制以及形成嵌合后 代。
[0076] 克隆過程的一個步驟包括將細胞的基因組轉移至去核的卵母細胞中，所述細胞含 有編碼一種或多種肝素生物合成酶或一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白的轉基因。如 在本申請中所使用的，"轉基因"指任意核酸分子片段，其人工插入細胞或其祖代，并且成為 由該細胞發育成的動物基因組的一部分。此類轉基因可以包括相對于轉基因動物部分或全 部是外源性(即外來)的基因，或者可以是與該動物的內源性基因具有同一性的基因。
[0077] 適宜的卵母細胞的哺乳動物來源包括山羊、綿羊、奶牛、家兔、非人靈長類等等。優 選地，卵母細胞來自有蹄類，和最優選地來自山羊或奶牛。分離卵母細胞的方法是本領域所 熟知的。主要地，該過程包括從哺乳動物例如山羊的卵巢或生殖道分離卵母細胞。有蹄類動 物卵母細胞易于獲得的來源是來自激素誘導的雌性動物。為了成功使用技術如基因工程、 核轉移和克隆，可以優選地在體內使卵母細胞成熟，隨后可以將這些細胞作為核轉移的受 體細胞使用，以及隨后使用精子細胞使其受精以便發育成胚胎。已成功將已在體內成熟為 中期II階段的卵母細胞用于核轉移技術。主要地，通過手術從非超排卵或超排卵的動物中 收集成熟的中期II卵母細胞，所述動物在幾小時前開始發情或注射了人絨毛促性腺激素 (hCG)或類似激素。
[0078] 用于預測在乳腺中表達的重組分子數量和質量的一個工具是通過誘導泌乳 (Cammuso，Gavin 等，Animal Biotechnology 11(1):1-17( 1999))。誘導泌乳能夠從轉基因 產生的早期階段而不是從由妊娠導致的第一自然哺乳期(將在一年以后)對蛋白進行表達 和分析。誘導泌乳可以通過激素或人工進行。
[0079] 在一些實施方式中，根據本申請提供的方法生產的肝素組合物還包含乳汁或部分 純化的乳汁。在一些實施方式中，本申請提供的方法包括從轉基因動物的乳汁中分離肝素 的步驟（參見例如Pollock等，Journal of Immunological Methods,231(1-2) :147-157 (1999))。
[0080] 通過下述實施例對本發明進行了進一步解釋，決不應將其解釋為進一步的限制。 在本申請中引用的所有參考資料(包括參考文獻、授權的專利、公開的專利申請和在審的專 利申請）的全部內容在此明確地通過引用并入，特別是教導了上文引用的。然而，任何參考 資料的引用均并非旨在承認該參考資料是現有技術。 實施例
[0081 ] 1.安全性研究
[0082] 1.1測試肝素對乳腺的影響
[0083] 對肝素對哺乳期乳腺的影響進行了評估。哺乳動物乳腺中山羊抗凝血酶(AT)的水 平為約2g/ml，發現其占血液的1%。可以以對應于lmg/ml、200mg/ml和50mg/ml生產水平的 水平將肝素輸注進入哺乳期山羊的乳腺中。由于山羊的乳腺能容納1升乳汁，因而可以在擠 奶和移除乳汁次日輸注肝素(輸注lg、200mg和50mg高分子量肝素）。可以連續一周每日輸注 肝素或直至在乳腺或血液中觀察到毒性。
[0084] 可以對待測動物乳汁和血液中肝素的水平進行檢測。早期的研究發現一些在乳腺 中產生的蛋白能夠以在乳汁中1%的水平滲漏進入循環中。還可以對整個測試期間乳汁的 體積進行監測以確定是否肝素影響泌乳。還可以對動物繼續擠奶一周以檢測對乳汁體積的 長期影響。還可以每日獲得血液樣品并通過測定aPTT(活化部分凝血活酶時間）監測肝素的 濃度和凝血性質。可以使用不同的肝素水平測定山羊血液中的aPTT。
[0085] 可以進行對照實驗，在其中IV注射給予山羊肝素。還可以確定血液中肝素水平導 致的出血問題。
[0086] 1.2肝素在哺乳期山羊中的毒性研究
[0087]進行一項研究以確定是否在乳腺中生產肝素對生產動物也具有顯著影響。通過轉 基因產生的蛋白能夠對乳腺直接地產生潛在影響。此外，已知蛋白可能滲漏進入循環系統。 為評估全身和輸注肝素對山羊的潛在影響，進行了如下所述的研究。在兩項實驗期間每日 至少一次對各只產乳動物抽血和收集乳汁以確定通過全身和乳房輸注途徑施用肝素的影 響。利用血清計算由aPTT指示的肝素水平和凝血時間。測定乳汁體積并確定乳汁中的肝素 水平。此外，注意乳汁的質量(顏色，粘稠度，凝塊、血液或乳腺炎的證據）。每日評估每只動 物的一般健康情況，包括直腸溫度。由于肝素是一種抗凝劑，因而還要每日檢查動物的任何 大體出血體征，如異常瘀傷或瘀斑。
[0088] 方法
[0089] 動物
[0090]每日使用約四鎊特殊配方的素食山羊飼料飼養6只正常的、非轉基因、哺乳期山 羊，并且給予其提摩西和苜蓿干草的組合以及自由飲水和取食平地和礦化的鹽塊。因為這 些是哺乳期動物，所以從其達到之日起每日擠奶。每日測定乳汁體積并記錄直腸溫度。第一 次或第二次實驗前的乳汁體積和直腸溫度可以參見下面的表7。
[0091] 血液收集
[0092] 人工束縛動物，以使得能夠辨認出其頸靜脈。將21號3/4英寸蝶形針頭（BD Vacutainer Blood Collection Set Ref 367251，Franklin Lakes，NJ USA)插入血管中， 并且將血液收集至2-1.8ml梓檬酸鈉真空采血管中（BD Vacutainer, Buffered Na Citrate，Franklin Lakes，NJ USA)。收集后(或收集血液和給予肝素后--見下文)拔出針 頭，并按壓收集位點以止血。各程序后均給予動物正強化(獎勵糧食）。
[0093]靜脈施用肝素
[0094] 如上所示將動物束縛。對上文所述的用于血液收集的蝶形針頭進行設計，以使得 可以通過真空采血管收集血液，或者可以將其與注射器連接。因此，收集血液后，將與血液 收集管連接的針頭部分除去，并連接含有肝素的注射器，緩慢注射肝素。通過針頭加入 0.4ml無菌生理鹽水沖洗以確保全部肝素被遞送。在這種方式中，將單一針頭位置用于血液 收集和肝素注射，避免了與第二個注射位點相關的任何額外的應激。
[0095] 表7:在第一次或第二次實驗之前動物的乳汁體積(升)和體溫(華氏度）。
[0096]
[0097] 乳汁收集
[0098] 從山羊送達之日起，每日一次使用便攜式擠奶器為所有山羊擠奶。在進行這一程 序時，將動物置于擠奶臺上。擠奶的一般步驟如下。擠奶人員徹底洗凈雙手并帶上乳膠檢查 手套。使用紙巾和水清潔乳房。然后使用干凈的紙巾擦干乳房。使用乙醇濕巾再次清潔乳 頭，進行預浸(FS_106Sanitizing Teat Dip，IBA Inc.，Millbury，MA USA)并使其干燥。用 手從乳頭取少量樣品以評估乳汁質量，進行痕色測試并將其冷凍以供進一步分析。然后將 擠奶器與乳房連接。擠奶后，使用乙醇清潔乳頭，并在擠奶后應用消毒劑(Ultra Shield Sanitizing Barrier Teat Dip, IBA Inc.，Millbury, MA USA)。確定乳汁體積，冷凍少量樣 品并保存在-80 °C臥式冰柜中以供后續測試。
[0099] 實驗1:對全身施用肝素的影響的研究
[0100] 連續6天每天在8AM、12點和4PM三次靜脈（IV)注射給予兩只山羊肝素。日程安排如 下:連續兩天，低劑量肝素，1，500單位(0.151111[10,000單位/1111]1￥，1'10[每日三次])，隨后 是連續兩天中劑量，6，000單位(0.6ml [ 10，000單位/ml ] IV，TID)，最后是連續兩天高劑量肝 素31，000單位(3.11111[10,000單位/1111]1￥，1'10)。這些劑量相當于在創建的用于生產的轉基 因動物乳汁/乳腺中靶向表達水平的1%。在各次注射肝素前從頸靜脈取血。此外，每日為山 羊擠奶一次并收集樣品。在這項實驗結束后且將其納入實驗2之前的一天對全身給予肝素 的山羊擠奶。
[0101] 實驗2:乳房輸注肝素
[0102] 將6只哺乳期的山羊分成3組每組2只山羊。每日使用擠奶器為所有山羊擠奶，并收 集血樣。在擠奶和收集血樣之后，使用乳頭輸注導管(Udder Infusion Cannula，IBA Inc.， Millbury，MA USA)向山羊的乳房輸注肝素。各組輸注給予低劑量（25,000單位）、中劑量 (100,000單位)或高劑量(500,000單位)肝素，其相當于基于每升乳汁探討3個不同的表達 水平。每只乳房的輸注體積小于50ml。這個方案共進行7天。在乳房輸注后，在對山羊擠奶8 天，收集在此期間的血樣和乳汁樣品。
[0103] 1.3 結果
[0104] 實驗 1
[0105] 在IV施用低劑量和中劑量肝素期間，aPTT小幅升高。在施用高劑量肝素后aPTT急 劇上升。在施用高劑量期間，4個中午和4PM樣品中的3個高于使用凝血儀能夠計算得到的最 大aPTT(>124秒）。過夜后第二高AM樣品(AM給予肝素之前）的aPTT時間回落至較為正常的水 平。任何劑量對乳汁體積和體溫均沒有影響。在任何時間均無瘀斑或異常出血的證據。僅在 第2天的高劑量給藥期間在中午和4PM檢查時對一只動物進行身體檢查發現肺音增加。一旦 高劑量全身給藥結束，這些肺音消失。
[0106] 實驗 2
[0107] 可以按照如下所示對輸注肝素的產奶量結果進行分析。在所有情況下，在將肝素 輸注進入乳房期間乳汁體積開始出現下降，并且在停止輸注肝素后似乎有所恢復。最大的 下降出現在輸注給予最大量肝素的一只動物中（根據輸注前生產的乳汁體積計算輸注肝素 的量）（如下表8所示）。表8還顯示了輸注肝素的量與aPTT之間的關系。在施用前3天aPTT與 輸注肝素的量具有相關性并且出現峰值，然后下降。在肝素乳房輸注后的"清洗"期期間 aPTT返回至正常水平(20-40秒）。肝素輸注水平與后肝素 aPTT水平似乎沒有直接的相關性。 [0108] 表8:對于三個輸注水平相對于aPTT時間的每個乳房每天的乳汁體積、肝素單位和 輸注mL。星號(*)表示10,000單位/mL，其他為20,000單位/111匕乳汁體積以升計。1^表示每個 乳房輸注肝素的mL數。aPTT時間以秒計。
[0109]
[0110] 1.4 結論
[0111] 實驗 1
[0112] 本申請已證實全身施用肝素對體溫或產奶量具有極小(如果有的話)影響。全身給 予低水平和中水平肝素似乎逐漸將aPTT增加至40-50秒(正常范圍為20-40)。全身給予高水 平肝素注射后對aPTT具有較大影響，通常使凝血時間增至超出儀器能夠檢測的范圍（> 124sec)。但是，過夜后(兩個高劑量之間)aPTT降至較低的40s，其與全身給予低水平和中水 平肝素時所見的結果類似。大體上無明顯的出血體征，如口腔粘膜、外陰或乳房瘀點。在給 予高水平肝素期間，在一只山羊中能夠聽見增加的"噼里啪啦"的肺音。然而，在此期間沒有 從鼻中排出任何血性分泌物的跡象。
[0113] 從這些結果中，能夠得出令人吃驚的結論，全身給予肝素6天不會導致已報道的肝 素的副作用瘀點、紫癜或瘀斑，并且不用將其從生產肝素的轉基因哺乳動物中排除。
[0114] 實驗 2
[0115] 研究發現連續1周每日一次將低劑量或中劑量肝素輸注至乳房對體溫具有極小影 響，不會產生任何出現體征并且不會使aPTT增至超過55秒。輸注高水平肝素顯著增加 aPTT， 并且輸注最高水平似乎具有全身影響，包括使體溫升高和增加呼吸音。使用最高水平輸注 給予山羊的乳房似乎產生炎癥應答并且顯著降低產奶量。然而，在這項實驗中，將山羊奶擠 出并將未經稀釋的純肝素直接輸注進入乳房。在生產肝素的轉基因山羊中，蛋白是由乳汁 生產的，因而是被稀釋的。此外，由山羊自身生產的肝素可能并不等同于所輸注的外源性肝 素。
[0116] 從這些研究中，能夠得出結論，低劑量和中劑量全身和輸注肝素對山羊的健康和 產奶量具有極小影響并且不用將其從生產肝素的轉基因哺乳動物中排除。
[0117] 2.生產肝素的轉基因動物的產生
[0118] 可以將攜帶具有不同修飾的酶的構建體引入來自已產生核心蛋白的動物品系的 基因組中。可以以假定以四糖合成起始和磺基轉移酶結束出現在通路中的順序引入構建 體。在各點上(例如加入新酶之后），可以將肝素從轉基因雌性動物的乳汁中分離。
[0119] 2.1四糖合成、EXT I和EXT II、NDST I和NDST II、磺基轉移酶
[0120] 可以將針對參與四糖合成的酶、EXT I和EXT II、NDST I和NDST II以及磺基轉移 酶的酶的編碼DNA連接至β酪蛋白載體并將該構建體顯微注射進入已經攜帶核心蛋白的動 物胚胎中。攜帶新構建體的子代能生長至成熟并且經檢測其能夠將四糖添加在核心蛋白 上。還可以將編碼ΕΧΤΙ和ΕΧΤΙΙ的基因連接至酪蛋白載體并將該構建體顯微注射進入已攜 帶核心蛋白的動物胚胎中。類似地，可以將這種方法用于編碼NDST I和NDST II以及磺基轉 移酶的基因。
[0121] 2.2具有多種肝素合成途徑基因的轉基因動物的產生
[0122] 可以將攜帶一組酶(例如NDSTI、NDSTII和C5差向異構酶）的轉基因品系與攜帶另 一組(例如核心蛋白以及四糖合成酶和EXT I和EXT II)的獨立的轉基因動物品系雜交。然 后可以通過繁殖程序鑒定用于補充乳腺中現有肝素合成活性的一組酶。
[0123] 在獨立、平行的程序中，可以對攜帶該途徑所需所有基因的較大構建體(使用BAC 或YAC)進行組裝。然后可以將這種較大的構建體引入動物基因組中。已將這種方法成功用 于構建攜帶較大的多重基因陣列(例如免疫球蛋白基因座)的轉基因動物。
[0124] 2.3分泌過程
[0125] 大多數糖胺聚糖蛋白是膜結合的或細胞內的。
[0126] 還可以對可溶性形式進行工程改造以輔助分泌。例如，使用GPI錨定將一些GAG蛋 白（蛋白多糖)連接至細胞表面。可以將錨定位點缺失以使得能夠生產可溶性版本。
[0127] 脂肪球分泌:可以在脂肪球膜中生產膜蛋白。
[0128] 2.4生產肝素的大量轉基因動物的產生
[0129] 可以通過體細胞核轉移(克隆)將構建體引入山羊或奶牛的基因組中。與奶牛相比 轉基因山羊具有產生時間更短的優勢。但是，轉基因奶牛每只動物產生的乳汁約為10倍并 且具有增強的可擴展性。而且，盡管與山羊相比奶牛的產生時間更長，可以通過對牛犢進行 激素誘導獲得顯著增加的奶量，以抵消一些產生時間對開發周期的影響。
[0130] 可以將較大的表達構建體轉染進入細胞如成纖維細胞，并選擇成功的克隆。然后 可以針對成功摻入全部相關肝素生物合成基因的這些克隆細胞進行篩選。該克隆程序能夠 導致產生大量攜帶肝素途徑的創建者。可以在山羊2個月（或牛6個月）時對其進行誘導以確 定是否已成功對核心蛋白進行修飾以便在該大型動物的乳腺中形成肝素。
[0131] 等效物
[0132] 認為前述書面的說明書足夠使本領域技術人員實施本發明。不能將本發明限制在 所提供的實施例的范圍，因為實施例旨在說明本發明的某些方面和實施方式。其他功能上 等效的實施方式在本發明的范圍內。除了本申請顯示和描述的那些以外，本發明的不同修 訂在前述描述的基礎上對本領域技術人員將是顯而易見的并且落入所附權利要求的范圍 內。本發明的優勢和目的并非必需被本發明的每個實施方式所涵蓋。
【主權項】
1. 一種生產肝素的方法，所述方法包括 提供在其乳汁中生產肝素的非人轉基因哺乳動物， 和 從所述轉基因哺乳動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。2. -種生產肝素的方法，所述方法包括 提供一種非人轉基因哺乳動物，所述非人轉基因哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表 達一種或多種肝素生物合成酶，和 從所述轉基因哺乳動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。3. -種生產肝素的方法，所述方法包括 提供一種非人轉基因哺乳動物，所述非人轉基因哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表 達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白，和 從所述轉基因哺乳動物乳腺生產的乳汁中收集肝素。4. 根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中所述轉基因哺乳動物是有蹄類。5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述有蹄類是山羊。6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述有蹄類是牛。7. -種生產肝素的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素生物合成酶， 和 從所述乳腺上皮細胞收集肝素。8. -種生產肝素的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素生物合成酶和 核心蛋白，和 從所述乳腺上皮細胞收集肝素。9. 一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物在其乳汁中生產肝素。10. -種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表 達一種或多種肝素生物合成酶。11. 一種轉基因非人哺乳動物，所述轉基因非人哺乳動物已被修飾以便在其乳腺中表 達一種或多種肝素生物合成酶和核心蛋白。12. 根據前述任意一項權利要求所定義的轉基因非人哺乳動物。13. 乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素生物合成酶。14. 乳腺上皮細胞，所述乳腺上皮細胞已被修飾以表達一種或多種肝素生物合成酶和 核心蛋白。15. 根據前述任意一項權利要求所述的方法、哺乳動物或細胞，其中一種或多種肝素生 物合成酶在乳啟動子的控制下。16. 根據權利要求15所述的方法、哺乳動物或細胞，其中所述乳啟動子是山羊β酪蛋白 啟動子。17. 根據前述任意一項權利要求所述的方法生產的肝素。18. -種組合物，所述組合物包含權利要求17所述的肝素。19. 根據權利要求18所述的組合物，還包含乳汁。
【文檔編號】C12P21/06GK105828603SQ201480070327
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月19日
【發明人】H.M.米德, W.G.加文
【申請人】Lfb美國股份有限公司