一種檢測肝素粗品基因的熒光定量pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域中的一種檢測肝素粗品基因的方法，具體設及一種檢測 肝素粗品基因的巧光定量PCR方法。
【背景技術】
[0002] 肝素是一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，在體內外都有抗凝血 作用。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、屯、肌梗死、屯、血管手術、屯、臟導管檢查、體外循環、 血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。肝素首先從肝臟發現 而得名，它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是動物體內一種天然抗凝血物質。天然存 在于肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸黏膜提取。我國是肝素產量最大的國家，國際市場 的肝素70%來自于中國。通常先從豬小腸粘膜中提取肝素粗品，然后純化，再生產肝素原料 藥。因而，肝素粗品作為下游原料，對肝素粗品基因的檢測很重要，直接影響肝素一大類藥 的質量。
[0003] 目前對于基因的檢測主要通過常規PCR的方法，而常規PCR技術是對PCR擴增反 應的終點產物進行定量和定性分析。無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。 巧光定量PCR是指在PCR反應體系中加入巧光基團，利用巧光信號累積實時監測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。巧光定量PCR技術是利用巧光 信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線 的分析對起始模板進行定量分析。
[0004] 巧光定量PCR作為一種高靈敏、高速度、高通量及特異性強的檢測技術，在生物分 析領域也具有廣闊的應用前景。該方法已用于基因擴增、擴增特異性分析、基因定量分析、 基因檢測、基因分型、SNP分析、RFLP多態性分析、單/多基因表達研究、高通量基因表達譜 研究。
[0005] 因此，我們設計了種巧光定量PCR的方法來檢測肝素粗品中的基因。包括肝素粗 品中總DNA的提取，巧光PCR擴增反應，數據分析。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種檢測肝素粗品基因的巧光定量PCR方法。本發明的目的 是通過W下技術方案來實現：
[0007] 一種檢測肝素粗品基因的巧光定量PCR方法，所述方法包括肝素粗品中總DNA的 提取、設計引物和探針、巧光PCR擴增反應W及數據分析，所述引物為上游引物和下游引 物，所述探針為巧光探針。
[000引進一步地，肝素粗品中總DNA的提取包括；①配制肝素粗品溶液；稱取肝素粗品30mg溶于1ml純化水，再用肝素酶作用緩沖液將上述溶液稀釋100倍，得到肝素粗品溶液； ②核酸酶的滅活；將肝素粗品溶液在恒溫儀上85°C恒溫5min，然后冰浴lOmin，并通過核酸 定量儀測定其中的DNA濃度，記為C總；⑨肝素酶降解：在200 y 1經核酸酶滅活過的肝素 粗品溶液中加入約0.Oliu的肝素酶，在恒溫混勻儀上震蕩混勻，25°C恒溫1她，離屯、取上清 液，4°C保存待用，作為酶解后的供試品溶液。
[0009] 進一步地，所述巧光PCR擴增反應包括配制PCR體系W及PCR體系擴增反應。
[0010] 進一步地，所述配制PCR體系包括DNA標準品溶液、酶解后的供試品溶液、陰性對 照溶液、上游引物溶液、下游引物溶液、探針溶液、Mastermix(PCR試劑預混液）化及水；所 述陰性對照溶液為純水。
[0011] 進一步地，所述巧光探針為在探針中加入了巧光基團得到巧光探針。
[0012] 進一步地，所述PCR體系擴增反應為；①在95°C下預變性lOmin;②在95°C下變性 15s;⑨在63°C下退火20s;④在72°C下延伸40s(巧光采集）；熱循環次數為40次。
[0013] 進一步地，所述數據分析包括標準曲線的繪制、系統適用性判斷W及供試品各基 因相對含量的計算。
[0014] 進一步地，所述標準曲線的繪制為由各濃度DNA標準品溶液與其對應的擴增曲線 Ct(threshold巧cle)值，得出標準曲線。
[0015] 進一步地，所述的數據分析中系統適用性判斷為；繪制標準曲線，標準曲線的確定 系數（R2) >0.98,斜率> -4.0,陰性對照的Ct(t虹esholdcycle)值應大于標準曲線最低 濃度樣品的Ct值，或沒有擴增。
[0016] 進一步地，所述的數據分析中供試品各基因相對含量的計算為；系統適用 性符合要求后，由標準曲線得出供試品中各基因濃度根據公式計算各種屬基因含 量：
【主權項】
1. 一種檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述方法包括肝素粗品 中總DNA的提取、設計引物和探針、熒光PCR擴增反應以及數據分析，所述引物為上游引物 和下游引物，所述探針為熒光探針。
2. 根據權利要求1所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：肝素 粗品中總DNA的提取包括： ① 配制肝素粗品溶液：稱取肝素粗品溶于純化水中，再用肝素酶作用緩沖液將上述溶 液稀釋后得到肝素粗品溶液； ② 核酸酶的滅活：將肝素粗品溶液在85°C下恒溫5min，然后冰浴lOmin，并通過核酸定 量儀測定其中的DNA濃度，記為C總； ③ 肝素酶降解：在經核酸酶滅活過的肝素粗品溶液中加入肝素酶，在恒溫條件下震蕩 混勻，25°C恒溫18h，離心取上清液，作為酶解后的供試品溶液，4°C保存待用。
3. 根據權利要求1所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 熒光PCR擴增反應包括配制PCR體系以及PCR體系擴增反應。
4. 根據權利要求3所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 配制PCR體系包括DNA標準品溶液/酶解后的供試品溶液/陰性對照溶液、上游引物溶液、 下游引物溶液、熒光探針溶液、Mastermix以及水；所述陰性對照溶液為純水。
5. 根據權利要求1或4所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于： 所述熒光探針為在探針中加入了熒光基團得到熒光探針。
6. 根據權利要求3所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 PCR體系擴增反應為：①在95°C下預變性lOmin;②在95°C下變性15s;③在63°C下退火 20s;④在72°C下延伸40s進行熒光采集；熱循環次數為40次。
7. 根據權利要求1所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 數據分析包括標準曲線的繪制、系統適用性判斷以及供試品各基因相對含量的計算。
8. 根據權利要求7所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 標準曲線的繪制為由各濃度DNA標準品溶液與其對應的擴增曲線Ct值，得出標準曲線。
9. 根據權利要求7所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所 述的數據分析中系統適用性判斷為：繪制標準曲線，標準曲線的確定系數多0.98,斜率 多-4. 0,陰性對照的Ct值大于標準曲線最低濃度樣品的Ct值，或沒有擴增。
10. 根據權利要求7所述的檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述 的數據分析中供試品各基因相對含量的計算為：系統適用性符合要求后，由標準曲線得出 供試品中各基因濃度C#根據公式計算各種屬基因含量：
【專利摘要】本發明涉及一種檢測肝素粗品基因的熒光定量PCR方法，包括肝素粗品中總DNA的提取、熒光PCR擴增反應以及數據分析。本發明簡潔明了，易操作，準確性高，所采用的熒光定量PCR檢測方法，巧妙的運用PCR技術的DNA高效擴增，高效、靈敏的檢測肝素粗品中的基因。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104774947
【申請號】CN201510179643
【發明人】周翔, 王軻, 陶翎, 顧春華
【申請人】常州千紅生化制藥股份有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月15日