一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法
【專利摘要】本發明公開一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，包括非洲菊的花托外植體預處理、接種及誘導培養、轉移誘導培養、幼苗的馴化與煉苗等步驟，培育出非洲菊脫毒幼苗。本發明涉及的非洲菊脫毒幼苗的培育方法，避免在培育過程中受病毒、病害因素的干擾，提高愈傷組織的形成數量與效率，培養周期短，提高幼苗成苗率，在非洲菊組培領域具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
_種非洲菊脫毒幼苗的培育方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，尤其涉及一種基于非洲菊花托外植體培育脫毒幼苗的方法。
【背景技術】
[0002]非洲菊是菊科大丁草屬的多年生宿根常綠草本花卉，為世界五大切花之一，因其花大、花艷、花色全且瓶插壽命長，深受人們歡迎，在我國種植范圍廣泛。
[0003]由于非洲菊大多自交不孕，雜交后代會分裂和變異，遺傳信息從親代傳給后代時由于栽培環境如光照、水分、溫度、營養等原因會導致非洲菊的品種退化，失去原有的典型性，通常表現為花朵變小、過渡色多、花形紊亂、花桿變細、抗性降低、花期縮短等。
[0004]現有技術中，非洲菊的一種常規繁殖方法是采用分株法，但其繁殖系數低，不能滿足大規模生產的需要，而且由于培養溫度、增殖芽的繼代代數以及激素濃度等因素易造成非洲菊種苗發生無性變異。
[0005]為迅速獲得大量品質優良的無病、無毒非洲菊種苗，利用組織培養技術開展非洲菊種苗生產是一種有效的途徑。組織培養技術在生產中包括兩個階段:室內培養和室外扦插培養，室內培養主要是利用組織誘導培養、增殖培養以及重要培養，而室外主要是將室內生根的組織誘導幼苗置于室外馴化和移栽培育成活。現有技術中非洲菊的組培方法在室內培養時存在組織誘導率低、誘導苗質量差且多弱苗等問題，而室外扦插培養過程中也存在幼苗增殖效率低、幼苗移栽成活率低等問題。
【發明內容】
[0006]基于現有技術的不足，本發明的目的是提供一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，是一種基于非洲菊花托外植體培育脫毒幼苗的方法，避免受病毒、病害因素的干擾，且培養周期短，成功率高。
[0007]具體步驟如下:
[0008](I)花托外植體預處理:
[0009]選取直徑I?2cm的花蕾，在4°C環境中冷藏3?5天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去荀片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05%的升萊水溶液中消毒5?8min，再用70 %的酒精消毒20?40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
[0010]以上涉及的百分比均為體積百分比。
[0011](2)外植體接種及誘導培養:
[0012]將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1°C，以藍光燈為光源，光照強度控制為400?800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
[0013]所述第一培養基的組成成分為:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2P04 300?450mg/L，CaCl2.2出0 320?350mg/L，MgS04.7出0 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeS04.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H2015?30mg/L，H3B03 8?10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H20 I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4-鵬苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?I.0mg/L，維生素BI 0.5?0.7511^/1，維生素86 1.0?1.5mg/L，煙酸1.0?1.5mg/L，蔗糖30?50g/L，瓊脂 10?15g/L，激動素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，鹽酸卩比卩多醇0.5?1.0mg/L，鹽酸硫胺素0.5?I.0mg/L，甲基亞硝基脲1.5?2.0mg/L,卩引噪丁酸I.5?2.0mg/L，丙氨酸5?I Omg/L，葉酸5?I Omg/L，調環酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙堿I.5?2.0mg/L，水解蛋白2.0?2.5g/L。
[0014](3)轉移誘導培養:
[0015]將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27± 10C，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800?2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽后，將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內繼續以相同的條件培養至形成非洲菊幼苗。
[0016]所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0017]所述第三培養基的組成成分在所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0018](4)幼苗的馴化與煉苗:
[0019]將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
[0020]所述逐步轉移到外部環境中的方法為:將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中逐天降低溫度并逐天增加光照強度，至與外部環境相同時，再培養2?3天即可移栽至普通土壤中，轉移過程的周期根據室外環境不同而調節，轉移過程的周期持續10?15天。
[0021]所述煉苗基質的組成成分為:珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，質量比為1:0.5?1.5:0.2?0.8:0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?
0.15:0.005?0.015，優選質量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0022]本發明涉及的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，具有以下技術效果:
[0023]1、對非洲菊的花托外植體采用冷藏消毒、復合消毒的方法，能有效減少誘導培養過程中受細菌污染的概率。
[0024]2、誘導愈傷組織階段用分段培養的方法，先采用藍光照射再采用熒光照射，二者的結合大大縮短了愈傷組織的愈傷分化時間，提高了愈傷組織的形成數量與效率。
[0025]3、本發明還提供了愈傷組織誘導培養的培養基，為非洲菊愈傷組織的誘導培養過程提供科學合理的營養，提高幼苗成苗率，本發明的非洲菊幼苗平均成苗率達到92.4%。
[0026]本發明不僅減少了非洲菊脫毒幼苗的培育周期，還提高了幼苗成苗率，在非洲菊組培領域具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0027]下面通過具體實施例，進一步對本發明的技術方案進行具體說明。應該理解，下面的實施例只是作為具體說明，而不限制本發明的范圍，同時本領域的技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發明范圍之內。
[0028]實施例1
[0029]—種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，具體步驟如下:
[0030](I)花托外植體預處理:
[0031]選取直徑I?2cm的花蕾，在4°C環境中冷藏3天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒5min，再用70%的酒精消毒30s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
[0032](2)外植體接種及誘導培養:
[0033]將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1°C，以藍光燈為光源，光照強度控制為600Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
[0034]所述第一培養基的組成成分為:KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L,CaCl2.2H20 340mg/L,MgSO4.7H20 190mg/L，EDTA 150mg/L,FeSO4.7H2040mg/L,MnSO4.4H20 60mg/L,ZnSO4.7H20 20mg/L,H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L,Na2MoO4.2H203mg/L，CoCl2.6H2O 0.3mg/L，4_碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，維生素BI 0.65mg/L，維生素B6 I.3mg/L，煙酸I.lmg/L，鹿糖40g/L，瓊脂 12g/L，激動素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，鹽酸卩比卩多醇0.8mg/L，鹽酸硫胺素0.8mg/L，甲基亞硝基脲1.6mg/L，卩引噪丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，葉酸8mg/L，調環酸I丐1.7mg/L，秋水仙堿1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。
[0035](3)轉移誘導培養:
[0036]將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27± 10C，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800?2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽后，將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內繼續以相同的條件培養至形成非洲菊幼苗；
[0037]所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸
0.5?2.0mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0038]所述第三培養基的組成成分在所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0039](4)幼苗的馴化與煉苗:
[0040]將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中每天降低溫度1°C，光照強度每天增加300Lx，至與外部環境相同時，再培養2?3天即可移栽至普通土壤中。
[0041]所述煉苗基質的組成成分為:珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，其質量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0042]實施例2
[0043]—種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，具體步驟如下:
[0044](I)花托外植體預處理:選取直徑I?2cm的花蕾，在4 °C環境中冷藏3天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05 %的升汞水溶液中消毒5min，再用70%的酒精消毒20s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。以上涉及的百分比均為體積百分比。
[0045](2)外植體接種及誘導培養:將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1°C，以藍光燈為光源，光照強度控制為400Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
[0046]所述第一培養基的組成成分為:KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L,CaCl2.2H20 320mg/L,MgSO4.7H20 180mg/L，EDTA 120mg/L,FeS04.7H2030mg/L，MnS04.4H2O 50mg/L，ZnS04.7H2O 15mg/L，H3B03 8mg/L，KI 5mg/L，Na2Mo04.2H2Olmg/L，CoCl2.6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，維生素BI 0.511^凡，維生素136 1.011^凡，煙酸1.011^凡，鹿糖3(^凡，瓊脂1(^凡，激動素0 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，鹽酸卩比卩多醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甲基亞硝基脲1.5mg/L，卩引噪丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，葉酸5mg/L，調環酸I丐1.5mg/L，秋水仙堿1.5mg/L，水解蛋白2.0g/L。
[0047](3)轉移誘導培養:將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27 ± I°C，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽后，將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內繼續以相同的條件培養至形成非洲菊幼苗。
[0048]所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸
0.5mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。所述第三培養基的組成成分在所述第二培養基基礎上添加了 6-芐氨基嘌呤1.5mg/L。
[0049](4)幼苗的馴化與煉苗:
[0050]將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
[0051 ]所述逐步轉移到外部環境中的方法為:將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中每天降低溫度1.5°C，光照強度每天增加400Lx，至與外部環境相同時，再培養2天即可移栽至普通土壤中。
[0052]所述煉苗基質的組成成分為:珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，質量比為1: 0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005 O
[0053]實施例3
[0054]一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，具體步驟如下:
[0055](I)花托外植體預處理:
[0056]選取直徑2cm的花蕾，在4°C環境中冷藏5天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒8min，再用70%的酒精消毒40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
[0057]以上涉及的百分比均為體積百分比。
[0058](2)外植體接種及誘導培養:
[0059]將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1°C，以藍光燈為光源，光照強度控制為800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
[0060]所述第一培養基的組成成分為:KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L,CaCl2.2H20 350mg/L,MgSO4.7H20 240mg/L，EDTA 180mg/L,FeSO4.7H2050mg/L，MnS04.4H2O 80mg/L，ZnS04.7H2O 30mg/L，H3B03 I Omg/L,KI 10mg/L，Na2Mo04.2H2O 5mg/L，CoCl2.6H2O 0.5mg/L，4_碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，維生素BI 0.75mg/L，維生素B6 I.5mg/L，煙酸I.5mg/L，蔗糖50g/L，瓊脂15g/L，激動素KT
1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，鹽酸卩比卩多醇1.0mg/L，鹽酸硫胺素I.0mg/L，甲基亞硝基脲2.0mg/L，卩引噪丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，葉酸10mg/L，調環酸鈣2.0mg/L，秋水仙堿2.0mg/L，水解蛋白2.5g/L。
[0061 ] (3)轉移誘導培養:
[0062]將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27± 10C，以熒光燈為光源，光照強度控制為2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽后，將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內繼續以相同的條件培養至形成非洲菊幼苗；
[0063]所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸
2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
[0064]所述第三培養基的組成成分在所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤2.0mg/Lο
[0065](4)幼苗的馴化與煉苗:
[0066]將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
[0067]所述逐步轉移到外部環境中的方法為:將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中逐天降低溫度并逐天增加光照強度，至與外部環境相同時，再培養3天即可移栽至普通土壤中，轉移過程的周期根據室外環境不同而調節，轉移過程的周期持續15天。
[0068]所述煉苗基質的組成成分為:珍珠巖100g、蛭石150g、鋸末80g、松樹皮80g、水苔50g、花泥15g、泥炭土 15g以及鈣鎂磷鉀肥1.5g。
【主權項】
1.一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)花托外植體預處理: 選取直徑I?2cm的花蕾，在4 °C環境中冷藏3?5天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05 %的升汞水溶液中消毒5?8min，再用70 %的酒精消毒20?40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體，以上涉及的百分比均為體積百分比； (2)外植體接種及誘導培養: 將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23± 10C，以藍光燈為光源，光照強度控制為400?800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織； (3)轉移誘導培養: 將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27 ± TC，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800?2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽后，將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內繼續以相同的條件培養至形成非洲菊幼苗； (4)幼苗的馴化與煉苗: 將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。2.根據權利要求1所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:步驟(2)所述第一培養基的組成成分為:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2PO4 300?450mg/L，CaCl2.2H20 320?350mg/L，MgS04.7H20 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeS04.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H20 15?30mg/L，H3BO3 8?10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H2O I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4_鵬苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?I.0mg/L，維生素BI 0.5?0.75mg/L，維生素B6 1.0?I.5mg/L，煙酸 1.0?1.5mg/L，鹿糖30?50g/L，瓊脂 10?15g/L，激動素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，鹽酸卩比卩多醇0.5?I.0mg/L，鹽酸硫胺素0.5?I.0mg/L,甲基亞硝基脲I.5?2.0mg/L，卩引噪丁酸I.5?2.0mg/L，丙氨酸5?10mg/L，葉酸5?10mg/L，調環酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙堿I.5?2.0mg/L，水解蛋白2.0?2.5g/L。3.根據權利要求1或2所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L; 所述第三培養基的組成成分在所述第二培養基基礎上添加了 6-芐氨基嘌呤1.5?2.0mg/Lο4.根據權利要求1所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:步驟(4)所述逐步轉移到外部環境中的方法為:將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中逐天降低溫度并逐天增加光照強度，至與外部環境相同時，再培養2?3天即可移栽至普通土壤中，轉移過程的周期根據室外環境不同而調節，轉移過程的周期持續10?15天。5.根據權利要求1所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:步驟(4)所述煉苗基質的組成成分為:珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥。6.根據權利要求5所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述煉苗基質中，珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土、鈣鎂磷鉀肥的質量比為1: 0.5?1.5:0.2?0.8:0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?0.15:0.005?0.015。7.根據權利要求6所述的一種非洲菊脫毒幼苗的培育方法，其特征在于:所述煉苗基質中，珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土、鈣鎂磷鉀肥的質量比為1: 1: 0.5:0.5:.0.3:0.1:0.1:0.01ο
【文檔編號】A01H4/00GK106069767SQ201610493769
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】許建中, 林少會, 孟劍華
【申請人】無錫南理工科技發展有限公司