專利名稱：脫氧核糖核酸分子的通用捕集法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種脫氧核糖核酸分子的通用捕集法，俗稱DNA探針-通用捕集法，可應用于分子醫學的疾病診斷。
近年來以核酸為基礎的分子診斷技術(簡稱核酸檢測“Nat”)在國際上發展很快，逐步將成為臨床檢驗中的常規手段。核酸檢測“Nat”是賴于核酸互補順序的特異性雜交來判別結果的，利用這個原則，在分子生物學領域中曾提出了“Southern吸印法”、“Northern吸印法”及斑點雜交法等，這些方法的特異性還是靠核酸雜交技術來確定被測的脫氧核糖核酸分子順序以達到診斷疾病的目的。國際公認的臨檢多聚酶鏈鎖式反應(簡稱PCR)檢測法，必須包括“探針雜交”這樣一個步驟。九十年代初，羅氏公司(Roche)首先發明了“直接捕集法(Capture)”，以代替難以被臨床接受的“Southern吸印法”，并廣泛地被有酶標板(ELISA板)基礎的臨檢實驗室接受，至今在北美、西歐和日本普遍被采用的Amplicor(羅氏公司PCR試劑盒的商標)仍屬“直接捕集法”。但是此法每種板只能測定一種病原體，成本費用高、特異性較差、操作不便、雜交效率不一致等，與日益增多的臨檢要求不相適應。
本發明的目的是在直接捕集法的基礎上加以改進而提供一種脫氧核糖核酸分子的通用捕集法，具有雜交特異性強，靈敏度高，雜交效率一致、臨檢準確、生產成本低、適用于定性、定量或分型等檢測、醫學診斷可靠等特點。
本發明的目的是這樣實現的一種脫氧核糖核酸分子的通用捕集法，包括下列步驟A)預雜交取12.5微升的1.6毫微克/微升接頭分子液加入到盛有100微升雜交液的通用捕集孔中，37℃保溫1小時，進行預雜交反應形成通用捕集雜交鏈，然后棄去孔中剩余液；B)雜交取100微升上述雜交液加入到上述孔中，取待測的生物樣品40微升PCR反應液與40微升變性液的混合液25微升加到上述孔中，37℃保溫1小時進行雜交鏈反應；C)洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然后棄去洗滌液；D)酶聯取50毫微克/毫升的酶聯液100微升加入到上述孔中，37℃保溫15分鐘進行酶聯反應；E)洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然后棄去洗滌液；F)顯色孔中加入顯色液100微升，25℃保持10分鐘后加入停顯液100微升；G)測定上述樣品移至在波長450毫微米的酶標儀上測定光密度數。
H)判別測得光密度數與內對照物光密度數參比，判別檢測結果。
本發明中所述的生物樣品為抽取的血樣經國際公認的臨檢多聚酶鏈鎖式反應(簡稱PCR)后的產物。
接頭液分子為a)乙型肝炎病毒接頭液分子；或b)丙型肝炎病毒接頭液分子；或c)丙種球蛋白接頭液分子；或d)愛滋病毒接頭液分子；或e)結核菌接頭液分子；或f)沙眼衣原體接頭液分子；或其它病原體接頭液分子，其接頭液分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，分別由長25個堿基的通用部分、長5到4毫微米的“空間”部分及約22-26個堿基的特異性部分構成，其特異性部分為只能與帶有乙型肝炎病毒PCR產物起雜交反應的乙型肝炎病毒特異性順序、或與帶有丙型肝炎病毒PCR產物起雜交反應的丙型肝炎病毒特異性順序、或與帶有丙種球蛋白PCR產物起雜交反應的丙種球蛋白特異性順序、或與帶有愛滋病毒PCR產物起雜交反應的愛滋病毒特異性順序、或與帶有結核菌PCR產物起雜交反應的結核菌特異性順序、或與帶有沙眼衣原體PCR產物起雜交反應的沙眼衣原體特異性順序或與任一種待測的特異性順序；上述接頭分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，其長度在50到60個堿基對左右，通過PE公司的392型DNA合成儀，采用固相亞磷酸三脂法進行DNA合成。它包括三個組成部分1．通用部分通用部分共長25個堿基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探針互補，能很快地與通用探針雜交。
2．“空間”介于通用部分和特異性部分之間，為了留出“空間”給二個分子形成夾心式的雜交鏈，我們的“空間”長度是5到4nm。
3．特異性部分特異性部分緊接著“空間”，約為22-26個堿基。它的長短是由它本身的G/C％，Tm是否與通用部分配合所決定的，也決定于它自身是否有二級級構，它的順序是選用在PCR產物，介于一對引物的中間順序，因而只能和PCR的產物雜交而與生物素標記的引物無反應，所以保證了該部分雜交的特異性。
接頭液的分子結構 1)其中通用部分長25個堿基對，其順序或用人為排列的(dA)25或5＇-ACg,Acg,gAA,cgA,AAc,ggA,Acg,Acgg-3＇或從pBlue KS-質粒順序中選取一段順序。pBlue KS-質粒順序已發表在Short,J.et al(1988)Nucleic AcidsResearch 16(15)7583具體順序為3＇-CCg,AgA,TAg,ggT,TgA,gTg,TTg,TTCC-5＇2)空間由二個空間分子(spacer-phosphoramidite)組成，每個空間為18個碳原子組成的一個長臂，可以在DNA合成儀上加入到接頭分子中。
具體結構為 (已發表在Nelson、P、et、al(1989)Nucleic Acids Res。17:7187)3)特異性部分都選自各待測病原體核酸的全序列中，HBV,HCV,HIV,TB,CT,β-globin等都可在“基因文庫”中查找出來。例它們的具體結構為(1)HBV 5＇-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3＇(2)HCV 5＇-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3＇(3)HIV 5＇-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3＇(4)TB 5＇-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3＇(5)CT 5＇-GATGAAAGACAGGAAATACGCATGA-3＇(6)丙種球蛋白5＇-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3＇通用捕集孔為具有活性基團的聚苯乙烯微孔板，其活性基團與接頭液分子的通用部分(即通用捕集探針)的互補寡核苷酸共價鍵地聯接固定；雜交液為0.9MNaCl檸檬酸緩沖液，使變性后的PCR產物或接頭分子液加入孔中后雜交反應的PH值維持在最適范圍內，它的離子濃度和保持溫度恰好與形成的二種雜交鏈(即通用雜交鏈和特異性雜交鏈)的Tm(融點溫度)配合而使雜交效率維持在一個穩定的水平上；變性液為0.2MNaOH溶液。
待測生物樣品40微升PCR反應液的制備待測生物樣品40ulPCR反應液中，20ul是主反應，20微升是待測血樣稀釋液。
a)20ul主反應液中含有氯化鉀200mM、三羥甲基氨基甲烷40mM,Taq DNA聚合酶0.5u/20ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1u/20ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml。
b)20ul待測血樣稀釋液制備取50ul裂解液，加50ul待測血樣，于裂解管中，37℃保溫1小時，取出冷卻至室溫，加入l00ul樣品中和液，混勻后，用樣品稀釋液稀釋5倍或25倍，然后取此稀釋液20ul，加至20ul主反應液中，體積總共40ul，進行多聚酶鏈式反應(簡稱PCR)。40ul PCR產物即是雜交中使用的待測生物樣品40ul PCR反應液。
洗滌液為0.15MNaCl溶液，其鹽濃度對維護雜交鏈起了保護作用，有效地洗去非特異性的吸附，保證了雜交反應的特異性；酶聯液為過氧化物酶和親和素的交聯物；顯色液為四甲基聯苯胺與過氧化氫的重量比1∶1混合液。
停顯液為5％硫酸溶液。
本發明中所述的試劑、儀器均由國內生產廠家提供，如上海生工生物工程公司、上海浩源生物科技有限公司及化工化學試劑商店。
本發明與現有技術相比，具有雜交特異性強、操作方便、雜交效率一致、適用于定量聚合酶鏈鎖式反應(PCR)、易于生產、價格較便宜等特點。
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例1取12.5微升的1.6毫微克/微升帶有乙型肝炎病毒特異性順序的接頭分子液加入到盛有100微升0.9MNaCl檸檬酸緩沖液的通用捕集孔中，37℃保溫1小時進行預雜交，然后棄去孔中剩余液，再加入100微升0.9MNaCl檸檬酸緩沖液，取生物樣品乙型肝炎病毒PCR的反應液40微升與40微升0.2MNaOH變性液的混合液25微升加入上述孔中，37℃保溫1小時進行預雜交，接著用0.15MNaCl洗滌液洗滌孔中產物，洗滌5次，每次用量300微升，洗滌后棄去洗滌液，接著加入100微升過氧化物酶聯液，37℃保溫15分鐘進行酶聯反應，再用0.15MNaCl溶液洗滌孔中產物5次，每次300微升，棄去洗滌液后，加入顯色液100微升，25℃保持10分鐘后加入5％硫酸停顯液100微升，樣品在波長450毫微米的酶標儀上測定光密度數，4次重復結果為1.123、1.061、1.139、0.932。
實施例2生物樣品為愛滋病毒PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.044、0.043、0.058、0.043。
實施例3接頭液分子的特異性部分為丙型肝炎病毒順序，生物樣品為丙型肝炎病毒PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.929、0.967、0.975、0.844。
實施例4接頭液分子的特異性部分為丙型肝炎病毒順序，生物樣品為丙種球蛋白PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.047、0.042、0.035、0.044。
實施例5接頭液分子的特異性部分為丙種球蛋白順序，生物樣品為丙種球蛋白PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為1.228、1.066、1.141、1.309。
實施例6
接頭液分子的特異性部分為丙種球蛋白順序，生物樣品為乙型肝炎病毒PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.040、0.044、0.064、0.061。
實施例7接頭液分子的特異性部分為愛滋病毒順序，生物樣品為愛滋病毒的PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.946、0.947、0.927、1.086。
實施例8接頭液分子的特異性部分為愛滋病毒順序，生物樣品為丙型肝炎病毒PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.047、0.048、0.044、0.043。
實施例9接頭液分子的特異性部分為結核菌順序，生物樣品為結核菌PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.869、0.734、0.748、0.772。
實施例10接頭液分子的特異性部分為沙眼衣原體順序，生物樣品為沙眼衣原體PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.945、0.883、1.058、0.980。
實施例11接頭液分子的特異性部分為沙眼衣原體順序，生物樣品為結核菌PCR產物，其余同實施例1，重復4次測得光密度數為0.051、0.046、0.054、0.041。
將上述實施例數據列入表1中
從表1中可以表明接頭液分子的特異性部分只與相對應的病原體進行雜交反應，與其它病原體無交叉反應，特異性強，雜交效率一致，達到了分子診斷疾病的目的。
表1中光密度是表明接頭液分子的特異性部分與相應的病原體進行雜交反應。經過酶聯反應，顯色反應在波長450毫微米的酶標儀上測得能表明病原體量的光密度讀數。在表1中光密度讀數0.04說明接頭液分子的特異性部分無雜交反應，光密度讀數＜0.1是空白數。
在表1中光密度讀數在0.9左右，說明接頭液分子的特異性部分與病原體進行雜交反應，光密度讀數值越高，例1.228，說明病原體與接頭分子的特異性部分進行雜交反應的量多，即是通常稱為強陽性，光密度讀數大于空白數2.5倍，例0.05×2.5=0.125，為弱陽性。
參考文獻A)直接捕集法乙型肝炎病毒DNA夾心式直接捕集法(J.of Clinical Micrlbiology 28,1411,1990)B)直接捕集法愛滋病毒DNA(J.of Clinical Micrlbiology 29,638,1991)C)分析生物化學(Analytical Biochemistry 198,138-142,1991)
權利要求
1．一種脫氧核糖核酸分子的通用捕集法，其特征在于包括下列操作步驟A)預雜交取12.5微升的1.6毫微克/微升接頭分子液加入到盛有100微升雜交液的通用捕集孔中，37℃保溫1小時，進行預雜交反應形成通用捕集雜交鏈，然后棄去孔中剩余液；B)雜交取100微升上述雜交液加入到上述孔中，取待測的生物樣品40微升PCR反應液與40微升變性液的混合液25微升加到上述孔中，37℃保溫1小時進行雜交鏈反應；C)洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然后棄去洗滌液；D)酶聯取50毫微克/毫升的酶聯液100微升加入到上述孔中，37℃保溫15分鐘進行酶聯反應；E)洗板用洗滌液對孔中反應產物進行洗滌5次，每次用量300微升，然后棄去洗滌液；F)顯色孔中加入顯色液100微升，25℃保持10分鐘后加入停顯液100微升；G)測定上述樣品移至在波長450毫微米的酶標儀上測定光密度數。
2．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于生物樣品為抽取的血樣經多聚酶鏈鎖式反應的產物。
3．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于接頭液分子為a)乙型肝炎病毒接頭分子液；或b)丙型肝炎病毒接頭分子液；或c)丙種球蛋白接頭分子液；或d)愛滋病毒接頭分子液；或e)結核菌接頭分子液；或f)沙眼衣原體接頭分子液；或g)其它病原體接頭分子液；上述接頭分子的結構為一條單鏈的寡核苷酸，其長度在50至60個堿基對左右，它包括三個組成部分通用部分通用部分共長25個堿基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探針互補，能很快地與通用探針雜交；“空間”介于通用部分和特異性部分之間，為了留出“空間”給二個分子形成夾心式的雜交鏈，我們的“空間”長度是5到4nm；特異性部分特異性部分緊接著“空間”，約為22-26個堿基，它的長短是由它本身的G/C％，Tm是否與通用部分配合所決定的，也決定于它自身是否有二級級構，它的順序是選用在PCR產物，介于一對引物的中間順序，因而只能和PCR的產物雜交而與生物素標記的引物無反應，所以保證了該部分雜交的特異性；接頭液的分子結構 1)其中通用部分長25個堿基對，其順序或用人為排列的(dA)25或5＇-ACg,Acg,gAA,cgA,AAc,ggA,Acg,Acgg-3＇或從pBlue KS-質粒順序中選取一段順序；具體順序為3＇-CCg,AgA,TAg,ggT,TgA,gTg,TTg,TTCC-5＇2)空間由二個空間分子(spacer-phosphoramidite)組成，每個空間為18個碳原子組成的一個長臂，可以在DNA合成儀上加入到接頭分子中；具體結構為 3)特異性部分都選自各待測病原體核酸的全序列中，HBV,HCV,HIV,TB,CT,β-globin等都可在“基因文庫”中查找出來；例它們的具體結構為(1)HBV 5＇-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3＇(2)HCV 5＇-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3＇(3)HIV 5＇-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3＇(4)TB 5＇-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3＇(5)CT 5＇-GATGAAAGACAGGAAATACGCATGA-3＇(6)丙種球蛋白5＇-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3＇
4．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于通用捕集孔為具有活性基團的聚苯乙烯微孔板，或磁粉或戴玻片等固相物。
5．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于雜交液為0.9MNaCl檸檬酸緩沖液。
6．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于變性液為0.2MNaOH溶液。
7．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于洗滌液為0.15MNaCl溶液。
8．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于酶聯液為過氧化物酶與親和素的交聯物。
9．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于顯色液為四甲基聯苯胺與過氧化氫的重量比1∶1混合液。
10．根據權利要求1所述的通用捕集法，其特征在于停顯液為5％硫酸溶液。
11．一種接頭分子液，它是權利要求3特征部分限定的接頭液分子。
全文摘要
本發明涉及一種脫氧核糖核酸分子的通用捕集法,可應用于分子醫學的疾病診斷。本方法包括預雜交、雜交、洗板、酶聯、洗板、顯色、光密度測定等步驟。利用接頭液分子的特異性部分與病原體核酸分子的雜交及通用部分與共價鍵地固定在通用捕集孔上的通用捕集寡核苷酸分子雜交而應用于臨床檢測。該法與直接法相比較,具有雜交特異性強,雜交效率一致、靈敏度高、操作方便、能做定性定量及分型等多種檢測、臨檢效率高、成本費用低等特點,適合日益增多的臨檢需要。
文檔編號C12Q1/68GK1309186SQ0013366
公開日2001年8月22日 申請日期2000年12月1日 優先權日2000年12月1日
發明者黃道培 申請人:黃道培