攪拌罐連續培養高產核酸熱帶假絲酵母的核糖核酸的方法

專利名稱：：攪拌罐連續培養高產核酸熱帶假絲酵母的核糖核酸的方法
技術領域：
：本發明涉及微生物
技術領域：
，具體涉及一種攪拌罐連續培養高產核酸熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)的核糖核酸的生產方法。
背景技術：
：核酸的發現已有100多年的歷史，但人們對它真正有所認識不過是近60年的事。遠在1868年瑞士化學家米歇爾(Miesher，F.18441895)，首先從膿細胞分離出細胞核，用堿抽提再加入酸，得一種含氮和磷特別豐富的沉淀物質，當時曾稱為核質。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內。生物體內核酸常與蛋白質結合形成核蛋白。自從有研究人員發現以核糖核酸為原料，用酶解法制造呈味性物質5’-核苷酸的方法以來，有力地促進了從微生物中提取核糖核酸新方法的研究。與動植物相比，微生物體內的蛋白質生物合成非常活躍，含有豐富的核糖核酸。酵母菌的核糖核酸是以核蛋白體核糖核酸(rRNA)，mRNA和tRNA的形式出現的。其中rRNA的含量占總量的85%以上。酵母細胞中核糖核酸含量豐富，為DNA的50100倍，這隨酵母種類、生長速率及培養基的組成等因素的不同而變化。已有報道指出，酵母細胞的核糖核酸含量為712%(以干物質計)。山口等(山口和夫，三上忠義，茨大農學術報告，13，69，1965)用含有2%葡萄糖的合成培養基研究比較了數十種酵母屬結果發現菌體中核糖核酸含量，從生長的誘導期至對數生長期達最高含量。單位培養液中的核糖核酸積累能力，一般以假絲酵母屬的酵母，特別是產阮假絲酵母和糙蹼假絲酵母(C.mycodema)為最佳，其核糖核酸的積累量在對數生長期末最高，而且因糖的種類不同所引起的差異較小；無機氮源以硫酸銨，有機氮源以蛋白胨、酵母浸出液為佳。核糖核酸最大的應用是作為用分解法生產5’_核苷酸的工業原料。核酸在核酸酶的作用下，水解為寡核苷酸或單核苷酸，其中脫氧核糖核酸水解后產生dAMP、dGMP、dCMP和dTMP,核糖核酸水解后產生AMP、GMP、CMP和UMP。核糖核酸及其酶分解產物腺苷酸、胞苷酸，鳥苷酸，尿苷酸等在醫藥、食品、化妝品以及農業等行業中具有重要的用途。近年來一些研究表明核糖核酸及其酶解物核苷酸具有維持機體免疫功能、抗氧化、提高機體蛋白質和鐵的生物利用率、降低膽固醇和抗衰老等多種生理功能。因此，核糖核酸的開發研究越來越受到重視。但是，以前產核糖核酸酵母的培養一般都采用傳統的鼓泡式連續培養，如文獻(王大琛1986年10月全國核酸技術學術會議)所述，采用該法發酵液中干菌濃度ll_12g/L，最高13-14g/L干菌體中核糖核酸含量14-15%。該菌株保藏編號為K-79。本發明的目的，就在于克服以上缺點和不足，提供一種菌體收率高，能耗低，適合于高效規模的工業化生產的攪拌連續發酵工藝。
發明內容本發明的目的在于建立和改進高核酵母的核糖核酸生產工藝，使菌體濃度達2023g/L和核糖核酸含量達1214%，裝料系數達到50-75%，同時通過連續發酵取消了間歇發酵過程中的消罐、空消、進料、實消的工藝，延長了實際生產時間，大幅度提高產量，降低生產過程能耗，減少了發酵廢水的排放。該工藝勞動強度小，生產程序簡單。一、菌種性狀和來源本發明通過將熱帶假絲酵母ATCC14246進行誘變篩選，得到一株高產核糖核酸的熱帶假絲酵母菌株，簡稱CPU-1，它不但核酸含量很高并且具有解脂假絲酵母可利用石蠟油為碳源的特征。高產核糖核酸的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)菌株CPU-1，已于2009年12月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提交保藏，保藏號為CGMCCNo.3558。本發明以實驗室保藏的熱帶假絲酵母ATCC12468為原始菌株，先利用以石蠟油為碳源的發酵培養基培養出能夠利用石蠟油的酵母菌，用稀釋平板法純化出單菌落作為誘變的出發菌株。根據一定范圍內不同濃度和時間梯度的NTG致死率曲線，得到合適的誘變條件后，用一定濃度的NTG對出發菌株進行誘變。由于本菌株有對高濃度氯化鉀敏感的特性，所以用影印平板法進行篩選出氯化鉀敏感菌株，接著再將它們進行3次紫外誘變，最后得到一株核糖核酸含量達到12%的菌株CPU-1，較原始菌株熱帶假絲酵母ATCC14246的核糖核酸含量提高了3倍。在此誘變篩選的過程中，所用的培養基為以下幾種。氯化鉀敏感性篩選培養基A葡萄糖3%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，尿素0.5%,FeS04*7H200.01%，瓊脂2.5%;氯化鉀敏感性篩選培養基B為培養基A中加入1.5mol/LKC1；分離單菌落的平板培養基及斜面培養基C葡萄糖3%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，尿素0.5%,FeS04-7H200.01%，瓊脂2.5%；利用石蠟油菌株的篩選培養基D石蠟油1%,(NH4)2S041.5%,KH2P040.9%,K2HP040.3%,MgS047H200.3%,FeS047H200.003%，酵母膏0.3%，玉米菜0.3%；種子培養基S葡萄糖4%，(NH4)2S041.5%,KH2P040.9%,K2HP040.3%,MgS047H200.3%,FeS047H200.003%，酵母膏0.3%，玉米漿0.3%，CaC030.5%；篩選發酵培養基M石蠟油1%，尿素0.8%，80%磷酸0.3%,KC10.15%,MgS047H200.1%,FeS047H200.003%,CaCl22H200.01%,NaCl0.1%，酵母膏0.3%，玉米菜0.3%。具體地，此誘變篩選的方法為首先將熱帶假絲酵母ATCC14246于培養基D中28°C培養1618h后挑取單菌落，該菌落即為可利用石蠟油的菌株，它作為誘變的出發菌株。接著，用0.5mg/ml亞硝基胍(NTG)在30°C誘變45min，也可以用1.5mg/ml或2.Omg/mNTG誘變30min，用影印平板法篩選出一株核酸含量達10%的氯化鉀敏感菌株D12，此處的影印平板法為在培養基A和B兩塊平皿的相同位置接種該菌，如果該菌株是對氯化鉀的敏感菌株，則會只在A平板上生長，不在B平板上生長，如果該菌株對氯化鉀不敏感，則會在A和B平板上都生長。然后，D12再通過三次紫外誘變，照射時間為60s，篩選出一株核酸含量高達12%的KC1敏感菌株菌株CPU-1，它同時還具有解脂假絲酵母的特征，可利用石蠟油為碳源，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.3558。該菌株具有以下特征1.菌落形態特征見附圖1。如圖1所示，在酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(YPD培養基)(酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%)瓊脂培養基上菌落為白色到奶油色，無光澤或稍有光澤，黏濕，軟而平滑或部分有皺紋，易被挑起。2.菌體形態特征在YPD液體培養基中培養，28°C，3天，細胞呈球形或卵球，大小為48X6lliim。3.菌株的生長及核酸含量曲線見附圖2。如圖2所示，012h為菌生長的對數期，培養基中的葡萄糖含量急劇下降，菌濃也快速增長，PH下降，而核酸增長則較平穩；12h以后，菌進入穩定期，葡萄糖基本消耗完畢，菌體總量的增長幅度不再顯著，核酸的含量與對數生長期相比有主見降低的趨勢。這是因為在核糖核酸聚合酶的活性在酵母對數生長期較高，經過了對數生長期以后，隨著時間的增加，核糖核酸聚合酶活性逐漸降低，所以菌體內核糖核酸的含量變少。而酵母菌在生長過程中代謝產生有機酸使培養液PH下降。因此在保持較高菌濃的前提下，確定種子培養和發酵培養的時間為1012h。且在間歇發酵過程中，酵母菌的比生長速率P最大可達到0.51T1。二、具體發酵步驟如下a.將CPU-1菌種在斜面培養基中以2831°C的條件下進行活化；b.將a步驟活化的菌種接種到搖瓶培養基中進行搖瓶培養；c.將搖瓶所得菌種在攪拌發酵罐中先在間歇發酵培養基中進行間歇發酵，412h后在不斷加入補料培養基的情況下進行連續發酵培養。d.提取分離核糖核酸.其中在斜面培養基中以2831°C培養的時間優選2436h。所述的斜面培養基優選由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵、25g/L瓊脂加入水中加熱搖勻所制備。搖瓶培養過程優選將斜面活化的CPU-1菌種接到裝有搖瓶培養基的搖瓶中，置于搖床中以100300r/min振蕩，2832°C發酵培養1030h。更優選搖床轉速為200r/min，溫度為30°C，培養時間是1824h。攪拌發酵罐中的間歇發酵的優選的方法是在攪拌罐中投入5075%攪拌罐體積的間歇發酵培養基，在115°C下，高壓滅菌30min；在溫度降到30°C以下時，將搖瓶所得的菌種以110%體積比的菌種量接種到發酵罐中，以溫度3034°C，pH3.84.5，溶氧率10-500%，壓力0.020.05Mpa,攪拌轉速180400r/min的發酵條件發酵412h，得到干菌濃為2023g/L。所述溶氧率10-500%的條件是在發酵過程中根據發酵液中的溶氧率來調整所通入無菌空氣的量。在發酵過程中根據pH下降的趨勢不斷加入氨水使pH保持3.84.5范圍內。間歇發酵412h后，pH下降趨勢略成緩慢，干菌濃度達到2023g/L時開始連續發酵，發酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75、溫度3034°C、pH3.94.5、溶氧率10-500%、壓力0.020.05Mpa、攪拌轉速180400r/min。干菌濃度2023g/L，核糖核酸含量約1214%。所述溶氧率10-500%的條件是在發酵過程中根據發酵液中的溶氧率來調整所通入無菌空氣的量。在發酵過程中根據PH下降的趨勢不斷加入氨水使pH保持3.94.5范圍內。本發明中搖瓶培養基優選含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml的磷酸。更優選的搖瓶培養基是由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸鎂、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸銨、0.15g/L的硫酸鋅、0.15g/L的硫酸亞鐵、0.lg/L的NaCl、l.8ml/L的磷酸加入水中搖勻所制備。培養基基質為水。本發明中間歇發酵培養基優選含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl、l3ml的磷酸。更優選的間歇發酵培養基由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸鎂、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸銨、0.15g/L的硫酸鋅、0.15g/L的硫酸亞鐵、0.lg/L的NaCl、2.0ml/L的磷酸加入水中搖勻所制備。本發明中補料培養基優選含2535g/L糖蜜、0.61.3g/L的硫酸鎂、0.61.3g/L的尿素、0.10.4g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.030.lg/L的NaCl和13ml的磷酸。更優選的補料培養基由28g/L糖蜜、0.8g/L的硫酸鎂、0.8g/L的尿素、0.2g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鋅、0.lg/L的硫酸亞鐵、0.06g/L的NaCl、l.5ml的磷酸加入水中搖勻所制備。優選用堿式法提取分離核糖核酸，將以上發酵液通過離心分離收集酵母菌體。然后配置氫氧化鈉溶液，該溶液的配置方法是將10%干酵母重量的氫氧化鈉和一定量的水混合，配置成濃度為的氫氧化鈉溶液。(該溶液中水分的量包括濕菌酵母中所含的水)。將菌體加入到以上所配置的氫氧化鈉溶液中，在20°c攪拌3040分鐘。離心收集上清液，并用鹽酸調PH至2.5，在210°C存放46h，再離心，將離心所得的沉淀干燥后即可獲得核糖核酸產品，其提取收率約為8090%。核糖核酸含量的測定方法如下取IOml發酵菌液進行離心8000rpm，IOmin,棄去上清，稱菌體濕重。用IOml生理鹽水懸浮細胞，離心8000rpm，10min，再用生理鹽水懸浮后取2ml菌懸液于干凈試管，再加入2ml高氯酸，70°C水浴20min，水浴過程中每5min震蕩一次，水浴后取Iml加入EP管中混勻，用紫外分光光度計于260nm處測0D。核糖核酸含量測A定的公式為:RNA%=A/W*R*32*稀釋倍數χ100其中，A為OD26tl吸光值，32為文獻單位光吸收值，W為菌體濕重g·R為酵母菌的干濕重比。采用本發明的發酵方法適合于工業化大生產，可以在203000L的發酵罐中生產，發酵液中干菌濃度可達2023g/L，干菌種核糖核酸含量達1214%。圖1是CPU-I的菌落形態特征圖2是CPU-I的生長及核酸含量曲線圖3是20L發酵罐間歇發酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖4是20L發酵罐連續發酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖5是200L發酵罐間歇發酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖6是200L發酵罐連續發酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖7是3000L發酵罐間歇發酵過程中CPU-I的生長代謝曲線圖8是3000L發酵罐連續發酵過程中熱CPU-I的生長代謝曲線具體實施例方式實施例1CPU-I在20L發酵罐的發酵培養1、CPU-I的活化將4°C保存的CPU-I菌種接種到斜面培養基上以30°C條件下培養32h。斜面培養基是由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵、25g/L瓊脂加入水中加熱搖勻所制備。2、CPU-I的搖瓶培養裝有IOOml搖瓶培養基的500ml搖瓶，在115°C條件下高壓滅菌20min。將斜面活化的CPU-I菌種接種到搖瓶中，置于搖床中以200r/min振蕩，30°C發酵培養20h，干菌濃度為15g/L。3、CPU-I在20L發酵罐發酵培養將14升間歇發酵培養基裝入20L發酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。等溫度降低到<30°C時，將搖瓶培養所得的600mlCPU-I菌種接種到發酵罐中，以溫度3132°C,pH4.04.1，溶氧率3040%，壓力0.05Mpa，攪拌轉速180400r/min的發酵條件進行發酵，期間由于發酵會產生大量的有機酸，致使PH下降，因此要不斷的在發酵液中加入氨水調整PH。間歇發酵過程菌的生長代謝曲線見圖3。約7h后，干菌濃約20g/L，pH下降趨勢略呈緩慢，開始連續發酵，稀釋率從0.3逐漸提高到0.75，以溫度3132°C、pH4.04.1、溶氧率3050%、壓力0.05Mpa、攪拌轉速180400r/min的條件進行發酵，在28h時稀釋率為0.51Γ1，在28h時稀釋率為0.61^，干菌濃度達21g/L，核糖核酸含量約14%。連續發酵菌的生長代謝曲線見圖4。實施例2CPU-I在200L發酵罐中發酵培養將150L間歇發酵培養基裝入200L發酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。等溫度降低到<30°C時，將實施例1方法所得的7.5LCPU-I菌種接種到發酵罐中，以3233°C，pH4.04.2，溶氧率3080%，通氣量為226M3/h，壓力0.020.04Mpa，攪拌轉速180400r/min的條件進行間歇發酵，期間由于發酵會產生大量的有機酸，致使pH下降，因此要不斷的在發酵液中加入氨水，共加入氨水835ml。間歇發酵培養過程中菌的生長代謝曲線及工藝參數見圖5。間歇發酵約7h后pH下降趨勢略成緩慢，測其殘糖量為0.63%，干菌濃度達到22.2g/L開始連續發酵。發酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75，以溫度3233°C，pH4.04.2，溶氧率3080%，壓力0.020.04Mpa,攪拌轉速180400r/min的發酵條件進行發酵，至88h稀釋率為0.51Γ1時，干菌濃度達22.4g/L，核糖核酸含量約14%。連續發酵過程中菌的生長代謝曲線及工藝參數見圖6。實施例3CPU-I在3000L發酵罐發酵培養將1800L間歇發酵培養基裝入3000L發酵罐中，在115°C條件下高壓滅菌30min。將將實施例1方法所得的75LCPU-I菌種接種到接種到發酵罐中，以溫度32°C33°C，pH4.04.1，溶氧率30120%，壓力0.20.4Mpa的條件進行間歇發酵，發酵5h后，測干菌濃度22.18g/L。其生長代謝曲線見圖7。然后開始連續發酵，稀釋率從0.33逐漸提高到O.75，以溫度3233°C，pH4.O4.1，溶氧率30120%、壓力0.020.04Mpa、攪拌轉速180400r/min的條件進行發酵。連續發酵88h稀釋率為0.51Γ1時，干菌濃度23g/L，核糖核酸含量約13.5%。其生長代謝曲線及工藝參數見圖8。以上所用發酵培養基的組成見表1，培養基基質為水。表1培養基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求一種微生物攪拌罐連續發酵法生產核糖核酸的方法，包括菌種活化、培養、發酵和提取分離，其特征是活化、培養、發酵的方法包括a.將保藏編號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌種在斜面培養基中以28～31℃的條件下進行活化；b.將a步驟活化的菌種接種到搖瓶培養基中進行搖瓶培養；c.將搖瓶所得菌種在攪拌發酵罐中先在間歇發酵培養基中進行間歇發酵，4～12h后在不斷加入補料培養基的情況下進行連續發酵培養。2.權利要求1的的方法，其中在斜面培養基中以2831°C培養2436h。3.權利要求1的方法，其中搖瓶培養過程是將斜面活化的保藏編號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌種接到裝有搖瓶培養基的搖瓶中，置于搖床中以100300r/min振蕩，2832°C發酵培養1030h。4.權利要求3的方法，其中搖床轉速是200r/min，溫度為30°C，培養時間是1824h。5.權利要求1的方法，其中攪拌發酵罐中的間歇發酵的過程是在攪拌罐中投入5075%攪拌罐體積的間歇發酵培養基，在115°C下，高壓滅菌30min；在溫度降到30°C以下時，將搖瓶所得的菌種以110%體積比的菌種量接種到發酵罐中，以溫度3034°C，pH3.84.5，溶氧率10-500%，壓力0.020.05Mpa，攪拌轉速180400r/min的發酵條件發酵412h。6.權利要求1的方法，其中連續發酵是在間歇發酵后，pH下降趨勢略成緩慢，干菌濃度達到2023g/L時開始連續發酵，發酵稀釋率從0.33逐漸提高到0.75、溫度3034°C、pH3.94.5、溶氧率10-500%、壓力0.020.05Mpa、攪拌轉速180400r/min。。7.權利要求1的方法，其中斜面培養基含30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸銨、0.lg/L無水硫酸亞鐵和25g/L瓊脂。8.權利要求1的方法，其中搖瓶培養基含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml/L的磷酸。9.權利要求1的方法，其中間歇發酵培養基含3545g/L糖蜜、1.01.4g/L的硫酸鎂、1.01.4g/L的尿素、0.10.5g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.050.2g/L的NaCl和13ml/L的磷酸。10.權利要求1的方法，其中補料培養基含2535g/L糖蜜、0.61.3g/L的硫酸鎂、0.61.3g/L的尿素、0.10.4g/L的硫酸銨、0.050.3g/L的硫酸鋅、0.050.3g/L的硫酸亞鐵、0.030.lg/L的NaCl和13ml/L的磷酸。全文摘要本發明涉及微生物
技術領域：
，具體涉及一種攪拌罐連續培養高產核酸熱帶假絲酵母的核糖核酸的方法。其特征是采用誘變得到的保藏號為CGMCCNo.3558的熱帶假絲酵母菌株在斜面培養基中以28～31℃的條件下進行活化、再將菌種接種到搖瓶培養基中進行搖瓶培養、將搖瓶所得菌種在攪拌發酵罐中先在間歇發酵培養基中進行間歇發酵，4～12h后在不斷加入補料培養基的情況下進行連續發酵培養、提取分離核糖核酸，即得。采用本發明的發酵方法適合于工業化大生產，可以在20～3000L的發酵罐中生產，發酵液中干菌濃度可達20～23g/L，干菌種核糖核酸含量達12～14％。文檔編號C12N1/16GK101805771SQ201010105789公開日2010年8月18日申請日期2010年2月3日優先權日2010年2月3日發明者盧建祥,周長林,曹靜,林忠,王偉,邱蔚然,金由辛申請人:南通秋之友生物科技有限公司;中國藥科大學