專利名稱：一種活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，特別涉及重組核糖核酸酶抑制劑的原核表達。
背景技術：
核糖核酸酶抑制劑(RNase Inhibitor,RI)是一種分子量約為50KDa的蛋白分子， 能夠結合和抑制哺乳類胰核糖核酸酶(RNase)超家族的多種成員。RI是一種胞漿蛋白，在許多哺乳動物組織中廣泛存在。它通過與多種核糖核酸酶緊密結合形成1 1的復合體，抑制這些核糖核酸酶的活性。盡管RNase超家族的一些成員的同源性有很大差異，RI與它們形成的復合物，其解離常數在0.5-200fM的水平(Lee FS, Shapiro R,Vallee BL. Tight—binding inhibition ofangiogenin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor.Biochemistry,1989, 28 :225-30 ；Shapiro R,Vallee BL. Interaction of human placental ribonucleasewith placental ribonuclease inhibitor. Biochemistry. 1991 ；30 :2246-2255)。RI 與這些配體 RNase 的高親和力，在自然界中極為罕見。在一些分子生物學研究中，RI可用于防止核糖核酸酶污染可能引起的問題，如在 mRNA反轉錄實驗，無細胞的體外蛋白翻譯實驗，和其他涉及RNA研究的工作中。天然核糖核酸酶抑制劑可從人胎盤中分離純化(Blacliburn P.Ribonucleaseinhibitor from human placenta :rapid purification and assay. J Biol Chem. 1979 :口484-7)，也可以從一些哺乳動物組織中提取純化(Gribnau AA, Schoenmakers JG, van Kraaikamp M，Bloemendal H. High purification of the RNaseinhibitor from rat liver by affinity chromatography. Biochem Biophys Res Commun. 1970 ；38 :1064-8 ；Garcia MA, Klebe RJ. Affinity chromatography of RNaseInhibitor. Mol Biol Rep. 1997 ；24 :231-3 ；Chatterjee J, Maiti TK, Dasgupta S.Isolationand partial characterization of ribonuclease inhibitor from goat liver. Protein PeptLett. 2006 ；13 :779-83)。對牛、豬、羊、小鼠和大鼠來源的 RI 研究 (Burton LE, FucciNP. Ribonuclease inhibitors from the livers of five mammalian species. Int J PeptProtein Res. 1982 ；19 :372-9)顯示，它們具有與人胎盤來源的 RI 相近的性質和氨基酸組成。隨著基因工程技術的發展，通過基因重組表達人、大鼠和豬RI，也在大腸桿菌和其它表達宿主獲得了成功(美國專利5，552，302 ；美國專利5，965，399 ；美國專利5，932，440 ； Klink TA，Vicentini AM，Hofsteenge J，Raines RT. High-Ievelsoluble production and characterization of porcine ribonuclease inhibitor. ProteinExpr Purif.2001 ； 22 :174-9 ；Park JH，Hwang IS，Kim KI，Lee JM，Park YM，Park CH，Chung IS. Functional expression of recombinant human ribonuclease/angiogenininhibitor in stably transformed Drosophila melanogaster S2 cells· Cytotechnology· 20080以大腸桿菌為宿主的原核重組表達方法，具有操作簡便、成本低廉等突出優點。然而，特定基因的表達依賴于諸多因素，有時基因表達會引起宿主細胞死亡。大腸桿菌表達時還會出現包含體表達，產生無活性蛋白產物，需要體外復性。人、大鼠和豬RI具有相近的性質和較高的基因同源性，其原核表達主要面臨無活性包含體表達的問題。克隆的人RI基因表達產物，以無活性的包含體形式存在，需要體外折疊復性，而其復性率很低；在人RI基因融合先導信號肽編碼基因，也無法獲得活性產物；而某些表達策略可直接導致宿主菌的死亡(美國專利5，552，302)。克隆的大鼠RI基因，需要與小片斷的其他基因序列融合表達，才能獲得表達產物，少量可溶性的活性蛋白和無活性的包含體并存于宿主菌內；克隆的豬RI 基因的原核表達可引起宿主菌生長抑制或死亡(美國專利5，965，399)。總的來說，由RI基因原核表達獲得活性產物的產量很低，一般在0. 25mg/L菌液的水平(Klink TA, Vicentini AM,Hofsteenge J,Raines RT. High-Ievelsoluble production and characterization of porcine ribonuclease inhibitor. ProteinExpr Purif. 2001 ;22 :174-9)。為提高 RI 基因原核表達的活性產物的產量，Klink等在該文獻采用Trp啟動子的表達系統，獲得豬RI基因的高效可溶性表達，高密度發酵時產量在15mg/L菌液或lmg/g濕菌體的水平，但需要更換培養液進行誘導，操作繁雜。RI蛋白分子含有30個左右的游離巰基，巰基氧化會導致RI的活性喪失，因此需在一定濃度的還原劑如DTT存在下保存和使用。小鼠RI的巰基排列與其它種屬的蛋白分子有所不同；美國New England Biolabs(NEB)公司所售重組小鼠RI (M0314)的說明指示， 小鼠RI具有明顯的抗氧化失活作用，可在很低濃度還原劑時保持活性。盡管已有商品化的重組小鼠RI提供，而且編碼小鼠RI的完全基因序列已經報告(NCBI序列號AF071546 ； NM_145135)，但其在大腸桿菌或其他表達宿主的有效重組表達活性產物的方法，尚無報告。
發明內容
本發明涉及一種重組核糖核酸酶抑制劑(RI)。本發明提供一種簡便易行和低成本高效獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的方法。本發明發現，將含有小鼠核糖核酸酶抑制劑(mRI)的編碼基因的重組質粒載體，轉化具有蛋白酶基因缺陷的工程菌，經過適當誘導， 可獲得較高水平活性產物的可溶性表達。實施本發明，需首先獲得編碼小鼠RI氨基酸序列的全長cDNA克隆。按照已知的完全基因序列(NCBI序列號AF071546 ；NM_145135)或相應多肽序列，用反轉錄PCR可直接獲得全長cDNA克隆。全長cDNA克隆也可通過cDNA文庫篩選的方法，或人工合成的方法獲得。人工合成的基因序列可以與天然cDNA序列相同，也可以按照小鼠RI氨基酸序列，用公知的設計方法合成不同的簡并編碼。將編碼小鼠RI的cDNA克隆，連接到表達載體中，是分子生物學領域公知的方法。 各種商品化的原核表達載體，可提供選擇。如PQE30和pQE80L(Qiagen)，可生成His_6(六組氨酸)標簽多肽融合的目的蛋白，該融合蛋白維持完全的核糖核酸酶抑制活性，并且可以用His-6特異性的金屬親和層析方法一步純化。其它類型的融合表達載體，如含有編碼 TrxA(硫氧還蛋白)的表達載體，可生成TrxA融合的目的蛋白。可溶性的活性蛋白和無活性的包含體并存于宿主菌內。通常，在較低溫度下長時間誘導，可溶性蛋白的表達量可獲提高。出于意料之外的是，經過常規的表達條件優化，重組小鼠RI (rmRI)在大腸桿菌中可溶性表達產物經純化后，產量明顯高于一般文獻的報道。本發明還意外發現，在不同宿主菌進行表達時，除可溶性表達的目的蛋白產量有所差異外，其產物的活性也有明顯差異。 在蛋白酶基因缺陷的BL21及其衍生的工程菌如BL21 (DE3)pLysS等，小鼠RI可獲高效可溶性表達，而其RNaseA抑制活性與人RI的活性相當；在TGl或ToplO等工程菌表達時，純化產物的RNaseA抑制活性明顯降低。在實驗室小規模O00_400ml搖瓶培養)誘導表達中，純化的活性rmRI產量可高達4-8mg/L，或lmg/g濕菌體，與文獻報告的最高可溶性表達 (Klink TA, Vicentini AM, Hofsteenge J, Raines RT. High-level soluble production and characterization ofporcine ribonuclease inhibitor. Protein Expr Purif. 2001 ； 22:174-9)產量相當，而操作簡單許多。表達的宿主菌經常規的破碎方法，如凍融法、超聲破碎法、其它機械或化學破碎方法，收取含有可溶性表達產物的上清液。活性rmRI產物可通過公知的蛋白純化技術進行純化，如鹽析法和各種層析方法。優選的方案中，活性rmRI產物可通過標簽多肽的親和層析技術，如His-6特異性的金屬親和層析方法，純化獲得。融合標簽多肽的rmRI，通常維持完全或部分的核糖核酸酶抑制活性。優選的方案中，標簽多肽可用特異性切割蛋白融合序列的蛋白酶切除。本發明獲得的活性rmRI，與重組表達的人RI具有基本一致的核糖核酸酶抑制活性，可用于防止核糖核酸酶污染可能引起問題的一些分子生物學研究中，或其他通過抑制核糖核酸酶活性取得一定生物學效應的體外和體內應用中。
圖1. mRI原核表達載體在不同宿主菌中的轉化效率。將A 空載體pQE30 ；B 表達蛋白mRI的重組質粒pQE30-mRNH ；C 表達蛋白mRI的重組質粒pQE80L_mRNH分別轉化到四種宿主菌 T0P10、TGI、BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)Rosetta 中。pQE30_mRNH 的轉化克隆明顯少于pQE80L-mRNH和空載體pQE30的轉化克隆。圖2.目的蛋白mRI的原核表達質粒pQE80L_mRNH在E. coli T0P10、TGU BL21(DE3)pLysS三種宿主菌中的表達。37°C，生長至菌液濃度0D600在0. 4時，ImM IPTG 誘導4h，收取全菌進行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導的相應宿主菌為空白對照。 右側箭頭標示為目的蛋白位置。圖3.重組質粒pQE80L-mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS宿主菌中的誘導表達。 370C，生長至菌液濃度0D600在0. 4時，ImM IPTG誘導4h，收取全菌裂解，上清和沉淀進行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導的宿主菌為空白對照。右側箭頭標示為目的蛋白位置。圖4.表達條件對重組質粒pQE80L-mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS中表達的影響。27°C培養至菌液濃度0D600為0. 8時，分別使用ImM和0. ImM IPTG誘導4小時或16 小時，收取全菌進行蛋白電泳(SDS-PAGE)。以未用IPTG誘導的宿主菌為空白對照。右側箭頭標示為目的蛋白位置。圖5. mRI重組質粒pQE80L_mRNH在E. coli BL21 (DE3)pLysS菌中的可溶性表達和純化。27°C培養至菌液濃度0D600為0. 8時，用ImM IPTG誘導16小時，收取全菌。裂解離心后，上清液經鎳親和層析，5 50mM咪唑溶液清洗，100 300mM咪唑溶液洗脫。蛋白電泳(SDS-PAGE)分離，右側箭頭所示為目的蛋白所在位置。
圖6. his-mRI蛋白分子量鑒定。飛行質譜(MALDI-T0F)測定his-mRI蛋白分子量為 51420。圖 7.重組質粒 pQE80L-mRNH 在 E. coli BL21 (DE3)pLysS, TGl 和 T0P10 三種宿主菌中可溶性表達純化比較。pQE80L-mRNH轉化的pLysS，TGI, ToplO，27°C培養至菌液濃度 0D600為0. 8時，用ImM IPTG誘導16小時，收取全菌。裂解離心后，上清液經鎳親和層析， 5 50mM咪唑溶液清洗，300mM咪唑溶液洗脫。ToplO菌中表達的蛋白有明顯降解。蛋白電泳(SDS-PAGE)分離，右側箭頭標示位置分別為目的蛋白His-mRI以及降解條帶位置。圖8.重組質粒pRLTEV-mRNH在Ε. coli BL21 (DE3) pLysS菌中的可溶性表達純化。 27°C培養至菌液濃度0D600為0. 1時，用0. ImM IPTG誘導8小時，收取全菌。裂解離心后， 上清液經鎳親和層析，300mM咪唑PBS溶液洗脫后，依次用TEV酶切去除His-TrxA標簽，硫酸銨沉淀mRI后重溶解蛋白樣品再次通過鎳親和層析，流出液經50%甘油PBS溶液透析，濃縮蛋白樣品。各樣品經蛋白電泳(SDS-PAGE)分離。圖9. TrxA-mRI蛋白分子量鑒定。飛行質譜(MALDI-T0F)測定A :TrxA_mRI蛋白分子量為66四8 ；B =TEV切除TrxA后，mRI蛋白分子量為50621。
具體實施例方式下述實施例的陳述是為更好地理解本發明的原理和應用，而不限定本發明的使用范圍。1.材料與方法牛胰RNase A購自北京沁源惠幟生物技術有限公司；hRI (重組人RI)為!Iomega 公司產品(商品名RNasin Ribonuclease Inhibitor)，酵母rRNA購自上海楷洋生物技術有限公司，使用之前經過純化處理。阿魏酸(FA)購自國藥集團化學試劑有限公司。 Ni-IDAAgarose購自威格拉斯生物技術有限公司。純化蛋白的定量分別用5μ 1，10μ 1，20μ 1濃度為0. 2mg/ml牛血清白蛋白 (BSA)作為標準品對照，與純化蛋白一同進行SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍染色，Quantikan 軟件對凝膠進行灰度掃描，依據BSA標準曲線計算目的蛋白含量。質譜分析取5μ 1蛋白樣品經a^phadex G-10離心柱脫鹽，得到的樣品與質譜基質FA 1 1混合點樣。經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0FMS) (MALDI-T0F/T0F Analyzer 4800plus, Applied Biosystem)對樣品蛋白進行定性分析。核糖核酸酶活性及核糖核酸酶抑制劑活性測定核糖核酸酶的活性測定參考文獻[Umansky SR, Piker EG, Adler W. Ribonuclease activity of rat thymus chromatinproteins. Experientia. 1974 ；30 (7) :734-6]白勺 TCA 'iji U fe， 25mM Tris-HCl (pH8. 0), ImM EDTA，0. 01 % BSA 為緩沖液，適量的 RNase A 以及 8 μ g 酵母 rRNA， 37°C室溫反應15min，放置冰上，加入等體積預冷的10% TCA，冰上放置15min。4°C 12000rpm 離心lOmin，取上清，0D280檢測光密度值。上述反應中加入不同濃度的待測核糖核酸酶抑制劑與5 μ g RNase A混合，測定核糖核酸酶抑制劑對RNase A的抑制作用。抑制5ng RNase A活性50%的RI活性，定義為1個活性單位(U)。2.小鼠RI cDNA的克隆取昆明種小鼠肺組織，用總RNA提取試劑RNAVzol (威格拉斯生物技術有限公司)按說明方法提取總RNA。5 μ g總RNA加入20 μ 1反轉錄體系中，該體系含有10 X RT-buffer 2 μ 1，隨機引物 200ng，dNTPs 0. 5mM, DTT IOmM, RNasin(Promega) IOu 和反轉錄酶 M-MLV H-(威格拉斯生物技術有限公司)1μ 1，42°C孵育50min合成cDNA第一鏈，70°C孵育IOmin 滅活 M-MLV，-20°C保存。設計和合成 PCR 上游引物 5 ‘ -ataagatctatgagtcttgacatcca gtgtgagc-3, Τ" iit 弓I · 5 ‘ -atagtcgactcaggaaatgatcctcagggaagg-3 ‘ (Invitrogen, Shanghai)，分別含有Bgl 11和Sal I酶切位點。100 μ 1 PCR反應體系中含有10 X PCR-buffer 10 μ 1, cDNA 2 μ 1, dNTPs (2. 5mM)4y 1，上下游引物(40 μ Μ)各 1 μ 1, LA Taq 2· 5u。PCR 反應經94°C預變性3min, 35個包括變性(94°C /30s)、退火(55°C /30s)、延伸(72°C /50s)的循環和一個最后的延伸(72°C/7min)步驟完成。反應結束后取5 μ 1 PCR擴增產物，0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約1. 4kb的PCR產物。PCR產物與pBSK-T載體連接，轉化ToplO感受態細胞。獲取含有插入片斷的陽性克隆。提取質粒，獲得的mRNH/pBSK經BglII和Mil酶切證實含有1. 4kb的插入片斷。mRNH/ PBSK經雙向序列測定(Invitrogen, Shanghai)，獲得小鼠RI的全長cDNA含有1371個堿基，測定編碼序列與已知小鼠基因序列(NCBI序列號AF071546 ；NM_145135)進行比對，其核酸序列的一致性達99%以上。基因序列的差異可能來源于不同小鼠種系的遺傳差異，但不能排除基因操作或序列測定時人為的誤查。該核酸序列編碼的蛋白序列與已知小鼠RI蛋白序列(NCBI序列號AF071546 ； NM_145135)進行比對，蛋白序列的一致性分別為98%和99%。與人、大鼠、豬等已知RI蛋白序列進行比對，其同源性分別為87%，94%和87%。3.小鼠RI cDNA的表達載體構建mRNH/pBSK質粒DNA經Bgl 11和Sal I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離純化1. 4kb的 DNA 片斷，分別與 BamHI 和 SalI 處理的 pQE30, pQE80L 載體(Qiagen)，及 BamHI 和 XhoI 處理的PRLTEV載體(威格拉斯生物技術有限公司)連接。連接產物轉化ToplO感受態細胞。 獲取含有插入片斷的陽性克隆。獲得的表達載體pQE30-mRNH和pQE80L_mRNH中，小鼠RI cDNA的5'端融合有編碼額外包含His-6(六組氨酸)的12個氨基酸殘基的載體基因序列， 它們表達目的蛋白(His6-mRI)的理論分子量為51212Da，表達載體pRLTEV-mRNH中，小鼠 RIcDNA的5'端融合有編碼額外包含TrxA(硫氧還蛋白)和TEV蛋白酶切位點(ENLYFQ) 的載體基因序列，它表達目的蛋白(TrxA-mRI)的理論分子量為65789Da ;TEV蛋白酶處理去除TrxA后，其蛋白的理論分子量為50256Da。4. His6-mRI的表達與純化表達載體pQE30-mRNH和 pQE80L_mRNH 的質粒 DNA 分別轉化 ToplO,TGUBL21 (DE3) pLysS 和 BL21 (DE3) Rosetta 感受態細胞。與 ToplO 和 TGl 相比，pQE30_mRNH 對 BL21 (DE3) PLysS和BL21 (DE3) Rosetta的轉化效率明顯降低，而pQE80L_mRNH對各種感受態細胞的轉化效率與空載體相當(圖1)。由于PQE80L載體含有編碼額外LacI的基因框架，能夠抑制目的基因的基礎表達，推測pQE30-mRNH在BL21 (DE3) pLysS和BL21 (DE3) Rosetta有一定的基礎表達，從而對該菌種產生毒性。經IPTG誘導后，含有pQE30-mRNH和pQE80L_mRNH 質粒的Top 10、TGl和BL21 (DE3) pLysS宿主菌均有額外的約50kD蛋白表達(圖幻。含有 pQE30-mRNH 和 pQE80L_mRNH 質粒的 BL21 (DE3)pLysS 和 BL21 (DE3) Rosetta 宿主菌在 IPTG 誘導后，生長明顯延緩。SDS-PAGE顯示，表達的宿主菌裂解后目的蛋白以包含體沉淀中為主(圖 3)。200 400ml經誘導表達的宿主菌，離心收取菌體，重懸于含1 % Triton-XlOO的 PBS中。經凍融和超聲破碎，離心收取含可溶性目的蛋白的上清液。上清液通過Ni-IDA瓊脂糖親和基質吸附，PBS清洗，和含20-300mM咪唑的PBS梯度洗脫，可獲得純化的His-mRI。 0. 1 ImM IPTG 27°C誘導16小時，目的蛋白表達量增高(圖4)，可溶性蛋白的收取量明顯提高。可溶性表達產物經鎳親和層析純化(圖5)，經質譜鑒定，單一峰顯示His-mRI分子量在51. 4kD左右(圖6)，與理論分子量基本一致，符合預期。在BL21 (DE3)pLysS宿主菌的His6-mRI產量為4 8mg/L菌液，或lmg/g濕菌體；ToplO、TGl宿主菌中產量相當或略低。與重組人RI的活性相比，BL21 (DE3)pLysS宿主菌的His6-mRI活性接近，但ToplO、 TGl宿主菌純化產物的RNaseA抑制活性明顯降低(表1)。在多次的表達實驗中，有時會遇到表達及純化產物出現降解的情況(圖7)，推測ToplO、TGl宿主菌的表達產物的活性較低與產物降解有關；而BL21 (DE3)pLysS宿主菌由于存在蛋白酶缺陷表型，可能表達產物不易降解，能維持較高活性。ToplO宿主菌以明顯降解片斷為主的表達產物仍維持較低活性(表 1)，也可能與殘留的少量未降解產物的活性有關。4. TrxA-mRI的表達與純化表達載體pRLTEV-mRNH的質粒DNA分別轉化BL21 (DE3) pLysS感受態細胞。經 0. ImM IPTG誘導后，有額外的約66kD蛋白表達，可溶性表達的目的蛋白進行鎳親和層析純化后，300mM咪唑PBS溶液洗脫，TEV酶切作用去除TrxA標簽后，飽和硫酸銨沉淀mRI蛋白，使用PBS溶液重溶解后的蛋白樣品，再次通過鎳親和層析，流出液經50%甘油PBS溶液透析濃縮蛋白樣品(圖8)。TrxA融合的蛋白產物優化表達，經純化后收取量約為4 5mg/L，經質譜鑒定，分子量為66. 3kD左右，與理論分子量基本一致(圖9A)，其比活性約為 16kunits/mg ；TEV酶切去除TrxA后，純化的mRI的收取量約為1 ang/L，質譜分析蛋白分子量為50. 6kD(圖9B)，比活性約為39kimits/mg，與重組人RI的活性相當。表1 :PQE80L-mRNH轉化不同宿主菌的His-mRI蛋白可溶性表達、純化與活性鑒定。
權利要求
1.一種在大腸桿菌來源的宿主菌中，通過轉化重組核糖核酸酶抑制劑編碼基因的原核表達載體，經過一定條件下的誘導，獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達的方法，特征在于(1)所述的核糖核酸酶抑制劑編碼基因，是小鼠核糖核酸酶抑制劑編碼基因(CDNA)；(2)所述的宿主菌，是具有蛋白酶基因缺陷的工程菌；(3)所述的誘導條件，是低于37°C培養溫度下誘導表達。
2.權利要求1所述的具有蛋白酶基因缺陷宿主菌，是BL21或其衍生的工程菌。
3.權利要求1所述的培養溫度，是在室溫下進行誘導表達。
全文摘要
一種活性重組核糖核酸酶抑制劑的高效可溶性表達方法。技術領域 生物工程。本發明公開了一種簡便易行和低成本獲得活性重組核糖核酸酶抑制劑的有效方法。將表達小鼠核糖核酸酶抑制劑(mRI)的編碼基因的重組質粒載體，轉化具有蛋白酶基因缺陷表型的工程菌，經過適當誘導，可獲得較高水平活性產物的可溶性表達。
文檔編號C12N15/12GK102234649SQ20101016205
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月5日 優先權日2010年5月5日
發明者孫婧慧, 王楠, 葛瑩 申請人:威志蘭斯醫學科技(北京)有限公司